当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法。
【背景技术】
[0002] 目前植物生物技术都以诱导愈伤组织、培养植物器官或是分离原生质体等方法进 行研宄，而形成层的分离培养方法近期才出现。
[0003] 愈伤组织为植物脱分化后形成的薄壁组织，但是经过脱分化后，其次级代谢产物 的量与种类都会减少，同时含有中央大液泡，在扩大培养(如发酵罐培养等）时中央大液泡 容易碎裂导致细胞死亡，培养环境苛刻。
[0004] 植物的器官培养一般包括植物根或是芽的培养，保持了植物的体细胞的一些状 态，相对于愈伤组织而言，次级代谢产物的含量较多，但由于其易分化成为植物个体，导致 其不能较好的用于工业生产。
[0005] 植物的原生质体不含有细胞壁，细胞较为脆弱，对渗透压，pH等要求特别严格，一 般用于转基因介导，再用于植株再生，很难用于工业生产中。
[0006] 由于形成层分生组织拥有无限增殖的特征，因而被称为"植物干细胞"。形成层细 胞系的分离和扩大培养在近期才出现，2010年11月，NatureBiotechnology中刊登了一篇 名为〈〈Culturedcambialmeristematiccellsasasourceofplantnaturalproducts)) 的文章，成功的分离扩大了红豆杉的形成层干细胞系。这种未脱分化细胞的细胞活性以及 次级代谢产物含量较愈伤组织多100倍以上，同时发现其具有大量小液泡结构，在工业生 产中具有更大的优势。
[0007] 在含有贮藏根的植物中，贮藏根的作用为吸收无机盐贮存养分，含有大量的淀粉 以及较多的次级代谢产物，而植物根的形成层是通过细胞横向分裂并分化成为根的髓部以 及韧皮部，因此贮藏根的形成层是这些植物根部增粗的主要组织。但是在生长过程中贮藏 根中含有大量的内生菌与共生菌。所以在作为外植体培养组织时需要进行深度灭菌来减少 组织培养过程中的污染。
[0008] 国际专利W02010/137878K0以及中国专利CN102459572A公开了银杏科的形成层 来源的植物干细胞及其分离方法提供了木本植物的形成层干细胞系的分离扩大的方法。
[0009] 国际专利W02009/038416EN以及中国专利CN101939415A公开了来自静止中心 的植物干细胞系及其分离方法。
[0010] 国际专利W02009/038417EN以及中国专利CN101939414A公开了将来自具有储藏 根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法，将人参、胡萝卜等一些贮藏根植物的 干细胞进行分离扩大。该方法将含有贮藏根植物的根进行切片，通过渗透压处理，使切片中 非形成层部分死亡或是不分裂，再通过适合的培养基将形成层干细胞系分离并扩大。
[0011] 目前检测其细胞是否为干细胞的方法有通过显微镜检查是否为含有大量小液泡 状态以及对辐射或是类辐射药物的敏感性来确定是否为植物干细胞系。
[0012] 现有技术的缺点存在以下方面，通过实际运用，模仿关于贮藏根形成层细胞分 离方法的专利的实验，发现在一些当归属植物中如当归（J/we/ica (Oliv.) Niels'),Angelicadahurica(Fisch.exHoffm. )Benth.etHook.f.exFranch.etSav)，紫花前胡（ofectfrsiFa(Miq. )Franch.etSavat)等植物中不能够分 离出形成层干细胞系。说明现有贮藏根形成层细胞分离技术方法在如上植物中不适用，需 要新的方法来处理这类植物，以分离出形成层干细胞系。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的培养 方法。
[0015] 本发明所采取的技术方案是： 当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，包括以下步骤： 1) 外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处 理，使外植体的表面和内部均无菌体存在； 2) 外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片； 3) 筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4°C~30°C条件下处理16~72h，使切片中 非形成层部分的细胞不发生分裂； 所述筛选培养基为含有蔗糖1?6%和琼脂7. 5~8. 5g/L的MS培养基，该培养基pH为2 ?12 ; 4) 分离培养：将上述筛选培养后的外植体切片取出放入切片液中进行恢复，然后再将 切片放入分离培养基中进行培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组 织细胞死亡或是不分裂；培养6~16天后获得初步分离出来的形成层细胞； 所述分离培养基为含有生长素〇. 1?2mg/L、蔗糖1?6%、琼脂7. 5~8. 5g/L的MS培养 基，该培养基pH为5.0?5.9 ; 所述生长素选自二氯苯氧乙酸（2,4-D)、吲哚丁酸（IBA)、萘乙酸（NAA)和吲哚乙酸 (IBA)中至少一种； 5) 继代培养：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5?16天，然后转移 至分离培养基中培养5?16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获 得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物 干细胞； 所述继代培养基为含蔗糖1?6%、0.2~1.2mg/L2,4-0、0.01~0.51^/1激动素〇、 0? 5~2mg/LNAA、7. 5~8. 5g/L琼脂、0? 08~0. 12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5. 0? 5. 9〇
[0016] 进一步的，上述步骤1)中所述灭菌处理的具体过程为：先进行表面灭菌，即对洗 净的外植体依次经乙醇溶液、次氯酸钠溶液、升汞溶液进行表面灭菌，清洗干净后；再进行 深层灭菌，即将表面灭菌后的外植体在防褐化深层灭菌液中振摇20?40min。
[0017] 进一步的，上述防褐化深层灭菌液为含有蔗糖1?6%、青霉素100~400mg/L、链霉 素 100~400mg/L、头孢霉素 100~400mg/L、多菌灵 0? 5~2g/L、L-抗坏血酸 100~400mg/L、柠檬 酸 100~400mg/L、0. 008%。~0. 020%。吐温-20 的 1/2MS培养基，该培养基pH为 5. 0 ?5. 9。
[0018] 进一步的，上述步骤2)中所述外植体切片厚0. 5?2mm，含有形成层。
[0019] 进一步的，上述步骤3)中所述筛选培养基的pH为2?5或8~12。
[0020] 进一步的，上述步骤4)中所述切片液为含有蔗糖1?6%、青霉素100~400mg/L、链 霉素 100~400mg/L、头孢霉素 100~400mg/L、L-抗坏血酸 100~400mg/L、柠檬酸 100~400mg/L的1/2MS培养基，该培养基pH为5. 0?5. 9。
[0021] 进一步的，上述步骤4)分离培养的培养条件和步骤5)中所述继代培养的培养条 件均为：温度为24~26°C、湿度为50~70%。
[0022] 进一步的，上述当归属植物包括当归(Oliv. )Diels、白]E Angelica dahurica(Fisch.exHoffm. )Benth.etHook.f.exFranch.etSav、紫花 Angelica decursiva(Miq. )Franch.etSavat>jE|tPfAngelica laxifoliata Angelica polymorpha Angelica biserrata(ShanetYuan) YuanetShan。
[0023] 当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞悬浮培养的方法，包括以下步骤：将 上述方法制备的植物干细胞以湿重40~120g/L接种于液体的悬浮培养基中，在温度为 23°C~27°C，转速为100~140rpm的条件进行培养，培养10~25天，即可； 所述悬浮培养基为含1?6%蔗糖、0? 2~2mg/L2, 4-D、0. 01~0. 5mg/L激动素KT、 0? 5~2mg/LNAA的B5培养基，该培养基pH为5. 0~5. 9。
[0024]当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的发酵罐培养方法，包括以下步骤：将上 述方法制备的植物干细胞接种于液体继代培养基中，接种量为每升培养基中含湿重28~32g 的植物干细胞，在温度为23°C~27°C，溶氧率为0. 20~0. 40,转速为100~140rpm的条件培养 10~25 天； 所述液体继代培养基为含1?6%蔗糖、0? 2~2mg/L2, 4-D、0. 01~0. 5mg/L激动素KT、 0? 5~2mg/LNAA、0? 08~0. 12g/L活性炭的B5 培养基，该培养基pH为 5. 0~5. 9。
[0025] 本发明的有益效果是： 本发明提供了一种新的植物形成层干细胞的制备方法，实现了对当归属植物贮藏根形 成层的植物干细胞的分离，并对其扩大培养的方法进行了研宄，提供了适应其扩大培养的 悬浮培养方法和发酵罐培养方法，这对当归属植物在药用植物组织培养方面提供新的制备 和培养方式，对当归属植物贮藏根形成层干细胞大量的工业生产奠定了基础，也为当归属 植物贮藏根形成层干细胞提供了新的细胞来源。
【附图说明】
[0026]图1为分离培养过程中当归贮藏根外植体切片的生长情况，其中a为切片从筛选 培养基中取出并进行分离培养的第1天的照片，b为分离培养第2天的状态，c为分离培养 第4天的状态，d为分离培养第6天的状态； 图2为继代培养稳定后，获得的形成层干细胞系； 图3为本发明制备的形成层干细胞与愈伤组织细胞的显微结构；a为形成层干细胞的 显微结构，b为中性红染色后的形成层干细胞，c为愈伤组织细胞的显微结构，d为中性红 染色后的愈伤组织细胞； 图4为本发明制备的形成层干细胞的中性红染色图； 图5愈伤组织细胞与本发明制备的形成层干细胞经博来霉素处理后的细胞死亡率； 图6为悬浮培养15天后形成层干细胞的状态； 图7为愈伤组织悬浮培养15天后的图片。
【具体实施方式】
[0027] 当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，包括以下步骤： 1) 外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处 理，使外植体的表面和内部均无菌体存在； 2) 外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片； 3) 筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4°C~30°C条件下处理16~72h，使切片中 非形成层部分的细胞分裂不发生分裂； 4) 分离培养：将上述筛选培养后的外植体切片取出放入切片液中进行恢复，然后再将 切片放入分离培养基中进行培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组 织细胞死亡或是不分裂；培养6~16天后获得初步分离出来的形成层细胞； 5) 继代培养：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5?16天，然后转移 至分离培养基中培养5?16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获 得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物 干细胞。
[0028] 优选的，上述外植体为当归属植物一年生幼苗的直径为0. 5?1cm含有形成层的 贮藏根。
[0029] 优选的，上述步骤1)中所述灭菌处理的具体过程为：先进行表面灭菌，即对洗净 的外