一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种重组链霉菌及其应用，具体涉及通过改造抗 生素前体的合成途径中的关键基因来提高抗生素的产量。
【背景技术】
[0002] 链霉菌属革兰氏阳性放线菌，在系统生物学上归于链霉菌属（Strptomyces)，具有 复杂生活周期和次生代谢途径。该属的许多成员都能产生多种具有生物活性的次级代谢产 物。目前已知的上万种抗生素中，有70%以上是由链霉菌产生的。除此之外，它还能产生免 疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂和多种胞外水解酶，如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等。
[0003] 在链霉菌产生次级代谢产物的过程中，氨基酸既可以作为碳源，也可以作为氮 源，还有许多氨基酸是一些次级代谢产物的前体，如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，它们的代 谢产物包括乙酰CoA、丙酰CoA、丁酰CoA与异戊酰CoA等，这些物质是大环内酯类抗生 素生物合成的前体。如阿维菌素的生物合成（HafnerEW，HolleyBW，HoldomKS，et al.Branched-chainfattyacidrequirementforavermectinproductionbyamutant ofStreptomyceavermitilislackingbranched-chain2-〇xoaciddehydrogenase activity[J].JAntibiot(Tokyo)，1991，44(3) : 349 ?356)、螺旋霉素链霉菌产生必特螺 旋霉素（李桢林，江维，王永红，等.Val、lie及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响 [J].中国抗生素杂志，2007,32(11) :660?668)、醌霉素的生物合成（YoshidaT，Katagiri K.InfluenceofIsoleucineuponquinomycinbiosynthesisbyStreptomyces sp. 732 [J] ?JBacteriol，1967, 93 (4) : 1327 ?1331)等。
[0004] 阿维菌素（avermectin)是一种由阿维菌素链霉菌（Streptomycesavermitilis) 发酵产生的一类大环内酯类抗生素，具有广泛的驱虫和杀虫活性。阿维菌素链霉菌发酵液 中通常含有8种阿维菌素组分Ala，Alb，A2a，A2b，Bla，Blb，B2a，B2b，其中，杀虫效果以B1 组分最佳，尤其是Bla组分。阿维菌素的作用机制独特，与常规化学杀虫剂不同，杀虫效果 是一般化学农药的几十倍，且不易使害虫产生抗性。阿维菌素的作用靶点是线虫及节肢动 物类寄生虫的神经传导介质Y-氨基丁酸。它对哺乳动物的毒性很小、选择性很高，且在植 物中的残留时间很短，土壤中的微生物能很快将其分解成无毒物质。由于阿维菌素的广谱、 高效、无残留、对动植物高度安全等突出优点，已在农业、畜牧业、医药等领域广泛应用，具 有广阔的市场前景和应用价值。
[0005] 此外，以阿维菌素作为母体，还开发出了一系列活性更高、选择性更强、对动植物 更安全的衍生产品，已经商业化的产品包括多拉菌素、伊维菌素、埃玛菌素等。
[0006] 阿维菌素在国内已经实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但是，阿维菌 素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。如何提高阿维菌素的产量，降低生 产成本，是阿维菌素研宄中的一个重要课题。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的需求，本发明提供一种重组链霉菌，该重组链霉菌通过过表达 乙酰乳酸合酶小亚基来促进乙酰乳酸合酶对该重组链霉菌中的L-异亮氨酸、L-缬氨酸和/ 或L-亮氨酸的生物合成，从而提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为 前体进行次级代谢的产物产量。本发明还提供一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨 酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物（如阿维菌素、必特螺旋霉素、醌霉素等）产量的 方法。
[0008] 根据本发明的第一方面，提供一种重组链霉菌，其中所述重组链霉菌过表达序列 表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。
[0009] 根据一种实施方式，通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因克隆到表 达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌。
[0010] 所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生 抗生素的链霉菌。例如可以为野生型链霉菌，或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉 菌。
[0011] 优选地，上述出发链霉菌选自阿维菌素链霉菌Streptomycesavermitilis、螺旋 霉素链霉菌Streptomycesspiramyceticus和链霉菌Streptomycessp. 732 中的一种菌 株。
[0012] 最优选，所述出发链霉菌是阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267) 〇
[0013] 所述表达载体优选为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。
[0014] 根据一种实施方式，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体为PSET152,将启动子和ilvH基因 片段插入PSET152的多克隆位点，得到重组表达载体。
[0015] 所述ilvH基因最优选是阿维菌素链霉菌中编码乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基 因，即序列表中的核苷酸序列1 ;所述启动子为序列表中的核苷酸序列3所示的红霉素抗性 基因强启动子ermE*p。
[0016] 最优选地，所述重组链霉菌为阿维菌素链霉菌Streptomycesavermitilis AV-2320-8,于2014年12月08日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC10146。
[0017] 根据本发明的又一方面，提供一种制备上述重组链霉菌的方法，包括在出发链霉 菌中过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。
[0018] 根据一种实施方式，通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因克隆到表 达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌。
[0019] 将所述重组表达载体引入出发链霉菌的方法可以采用生物工程领域的常用方法， 例如结合转移法、电转化法、原生质体转化法等。
[0020] 优选为结合转移法。优选地，首先将表达载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆 菌ET12567 (PUZ8002)中，收集抗性菌落再与所述出发链霉菌做结合转移。
[0021] 所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生 抗生素的链霉菌。例如可为野生型链霉菌，或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌。
[0022] 优选地，上述出发链霉菌选自阿维菌素链霉菌Streptomycesavermitilis、螺旋 霉素链霉菌Streptomycesspiramyceticus和链霉菌Streptomycessp. 732 中的一种菌 株。
[0023] 最优选，所述出发链霉菌是阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267) 〇
[0024] 所述表达载体优选为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152。
[0025] 所述ilvH基因最优选是阿维菌素链霉菌中编码乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基 因，即序列表中的核苷酸序列1 ;所述启动子为序列表中的核苷酸序列3所示的红霉素抗性 基因强启动子ermE*p。
[0026] 根据本发明的另一方面，提供一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮 氨酸为前体进行次级代谢的产物产量的方法，所述方法包括利用上述重组链霉菌进行发酵 的步骤。
[0027] 根据本发明，以阿维菌素链霉菌（Streptomycesavermitilis MA4680 (ATCC31267)))为出发菌株，得到的重组阿维菌素链霉菌，在摇瓶培养240小时后， 阿维菌素产量可达到3486. 32±497. 97yg/mL，是出发菌株阿维菌素产量的5. 13倍。
[0028] 本发明具体实例所构建的重组阿维菌素链霉菌