tomycesavermitilisMA4680 (ATCC31267)，作 为出发菌株，该菌在平板上产灰白色孢子。
[0058] 将含有实施例1中构建的ilvH基因表达质粒pH-152的E.coli ET12567(PUZ8002)与上述阿维菌素链霉菌进行结合转移，涂布于含有10mMMgClJ^MS平 板上，28°C培养16?20h后，用lmL含1000yg萘啶酮酸和1000yg安普霉素的无菌水均 匀覆盖，在28°C培养5?7天，长出的菌落即为转化子，转化子经质粒提取及PCR验证正确 后，进行下一步的发酵研宄。
[0059] 所得转化子即根据本发明的构建方法获得的重组链霉菌。该重组链霉菌命名为阿 维菌素链霉菌StreptomycesavermitilisAV-2320-8,保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC10146。该菌株最佳培养条件为28°C，pH接近中性， 在固体培养基（如MS)上培养5-7天，会产生灰白色孢子，气丝少，基丝少。
[0060] 实施例3、重组菌株的发酵研宄
[0061] 1、阿维菌素链霉菌的摇瓶发酵
[0062] 阿维菌素链霉菌出发菌株阿维菌素链霉菌Streptomycesavermitilis MA4680(ATCC31267)及实施例2获得的重组菌在斜面培养基上长出丰富的孢子后，对阿 维菌素链霉菌转化子的阿维菌素产量水平进行测试。挖取斜面菌苔lcm2,将其接入装有 40mL灭过菌的种子培养基的种子瓶，28°C摇床培养44?48小时，转速200rpm，旋转半径为 50mm，得到种子培养液。取上述种子培养液按5% (体积百分比）的接种量接种于装有30mL 灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，28°C摇床培养10天，放瓶，用HPLC法测定阿维菌素的发 酵单位，具体HPLC分析如下述步骤2所述。
[0063] 本实验中的斜面培养基（葡萄糖1.5%、牛肉膏0.3%、天冬酰胺0.05%、 KH2P040. 05%、琼脂1. 8% )，种子培养基（终浓度为30g/L的玉米淀粉、终浓度为g/L的黄 豆饼粉、终浓度为l〇g/L的花生饼粉、终浓度为4g/L的酵母粉、终浓度为0. 03g/L的C〇Cl2) 和发酵培养基（终浓度为150g/L的玉米淀粉、终浓度为28g/L的豆柏粉、终浓度为9g/L的 酵母粉、终浓度为0. 25g/L的（NH4)2S04、终浓度为0. 02g/L的C〇Cl2、终浓度为0. 022g/L的 Na2M〇04j#浓度为0. 0023g/L的MnS04、终浓度为4000U/L的淀粉酶和终浓度为0. 8g/L的 CaC03)。（参见中国专利申请No. 200810227639. 8, 一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株， 该专利申请的全文通过引用合并于本文中。）
[0064] 2、发酵产物的HPLC分析
[0065] 1)样品处理：取l.OmL发酵液，加入9.OmL甲醇，超声波震荡30分钟以上，静置 10-20分钟；
[0066] 2)取lmL上清液，用0. 2ym的微孔滤膜过滤，获得滤液进行HPLC(Agilent1200 高效液相色谱仪）分析。
[0067] 3)HPLC分析条件：C18反向柱（Agilent)，柱长150mm，柱内径4. 6mm，流动相为甲 醇：水（90:10)，流速为1.0111171^11，自动进样器进样，进样量为10 1^，检测波长为24511111。 在此条件下，阿维菌素Bla标准品（DR，Germany)的保留时间为6分钟左右，计算发酵滤液 中保留时间为6分钟左右出的峰面积，计算阿维菌素Bla产量。实验设3次重复，结果取平 均数。
[0068] 图2的发酵结果表明，含有ilvH表达载体的转化子的阿维菌素发酵单位与出发菌 株相比明显提高，增加了 4倍左右。
[0069] 应理解，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤和条件所做的 修改或替换，均属于本发明的范围。
【主权项】
1. 一种重组链霉菌，其中所述重组链霉菌过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳 酸合酶小亚基ilvH。
2. 根据权利要求1所述的重组链霉菌，其中通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的 ilvH基因克隆到表达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉 菌，其中所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体产生抗 生素的链霉菌；优选地，所述出发链霉菌选自阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis、 螺旋霉素链霉菌 Streptomyces spiramyceticus 和链霉菌 Streptomyces sp. 732 中的一种 菌株；更优选，所述出发链霉菌是阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680。
3. 根据权利要求2所述的重组链霉菌，其中所述表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载 体； 优选穿梭载体为PSET152,将启动子和所述ilvH基因片段插入pSET152的多克隆位点， 得到重组表达载体； 更优选地，所述ilvH基因是序列表中的核苷酸序列1所示的阿维菌素链霉菌中编码乙 酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因，所述启动子为序列表中的核苷酸序列3所示的红霉素抗性 基因强启动子ermE*p ; 最优选地，所述重组链霉菌为阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis AV-2320-8,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 10146。
4. 一种构建权利要求1?3中任意一项所述的重组链霉菌的方法，包括在出发链霉菌 中过表达序列表的氨基酸序列2所示的乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述出发链霉菌是以L-异亮氨酸和/或L-缬氨 酸和/或L-亮氨酸为前体产生抗生素的链霉菌；优选选自阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis、螺方定霉素链霉菌 Streptomyces spiramyceticus 和链霉菌 Streptomyces sp.732中的一种菌株；更优选为阿维菌素链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中通过将编码所述乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因 克隆到表达载体，再将得到的重组表达载体引入到出发链霉菌获得所述重组链霉菌，优选 地，首先将表达载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567 (pUZ8002)中，收集抗性 菌落再与所述出发链霉菌做结合转移。
7. 根据权利要求6所述方法，其中所述表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体 PSET152。
8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述ilvH基因是序列表中的核苷酸序列1所示的 阿维菌素链霉菌中编码乙酰乳酸合酶小亚基的ilvH基因，所述启动子为序列表中的核苷 酸序列3所示的红霉素抗性基因强启动子ermE*p。
9. 一种提高链霉菌中以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产 物产量的方法，所述方法包括利用权利要求1?3中任意一项所述的重组链霉菌进行发酵 的步骤。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述以L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸为前 体进行次级代谢的产物是抗生素，优选是阿维菌素。
【专利摘要】本发明公开了一种重组链霉菌、其构建方法及提高抗生素产量的方法。所述重组链霉菌过表达乙酰乳酸合酶小亚基ilvH。通过该重组菌过量表达乙酰乳酸合酶调节亚基基因，可显著提高以L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸和/或L-亮氨酸为前体进行次级代谢的产物(如抗生素)的产量。CGMCC No.1014620141208
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-76, C12P19-62, C12N15-60, C12R1-465
【公开号】CN104531598
【申请号】CN201510007574
【发明人】张立新, 刘钇君, 刘梅, 朱华, 张庆, 高鹤永, 刘新利, 帅辉, 唐丹
【申请人】齐鲁工业大学, 中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月8日