一种vbnc联苯降解菌的分离筛选方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于污染物微生物降解领域，尤其涉及一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法及应用。
【背景技术】
[0002]自然环境中存在大量的微生物，利用纯培养技术仅能对自然界中0.01%-10%的微生物进行分离鉴定，尚有90%以上的微生物因处于活的但非可培养(“viable butnon-culturable”，简称VBNC)状态而未被认知。VBNC状态菌作为自然界中未能开发利用的绝大部分微生物资源，虽然基于非培养手段可以获取其多样性及菌群结构信息，但对于菌株相关生态功能及基因型的阐述，分离纯培养是不可或缺的。对VBNC状态菌可培养化的研宄，将为重新认识和评价微生物在食品发酵、农业、环保等领域的作用提供新的科学依据。
[0003]藤黄球菌(MicrococcusIuteus)复苏促进因子(resuscitat1n-promotingfactor,简称Rpf)的发现是VBNC状态菌复苏的主要突破。藤黄球菌Rpf具有胞壁溶解酶活性，其活性中心非常保守，预测该位点在细胞壁溶解过程中起到重要作用。另外，由藤黄球菌分泌的Rpf蛋白的活性要高于合成的Rpf蛋白，且纯Rpf蛋白易失活。同时，在藤黄球菌上清液中分离出至少具有两种Rpf功能(溶解酶活性)的蛋白，其分子量大于Rpf蛋白。因此，藤黄球菌胞外分泌物(“Extracellular organic matter”，简称EOM或促进剂SRpf)中含有至少3种具有溶解酶活性的蛋白，除此之外，促进剂SRpf中还含有多糖、脂类和多肽等多种大分子物质，可为微生物的生长提供碳源及氮源。由此可知，基于环境功能与微生物资源角度，利用促进剂SRpf探索环境中的VBNC状态菌群，更为经济方便。
[0004]联苯(Biphenyl)是一种有两个苯环组成的芳香族化合物，天然存在于煤焦油、原油、天然气中，通过化石燃料的燃烧进入环境中。在工业生产中，联苯中的氢原子被氯原子不同程度取代所形成209种同系物，这一类化合物称为多氯联苯(Polychlorinatedbiphenyls,简称PCBs)。PCBs因具有较好的阻燃性、高绝缘性及热稳定性，曾被广泛应用于变压器、电容器绝缘油、燃料分散剂、润滑剂、增塑剂和涂料等。PCBs属于难降解有机污染物，由于环境持久性及“三致”效应而成为目前广泛关注的典型有机污染物，虽然PCBs已禁用多年，但它所造成的环境污染问题随着研宄的深入而日益突出。传统的物理和化学方法因存在低效、二次污染等问题而成为应用瓶颈，微生物作为大量存在的自然资源，且微生物降解治理技术具有安全、高效、经济等特点，因此，筛选和构建高效PCBs降解菌成为修复PCBs污染环境的研宄热点。
[0005]自1973年Ahmed首次证明联苯降解微生物具有降解PCBs同系物的功能。从此，更多的研宄工作开始关注联苯降解菌对PCBs同系物转化能力这一方面。PCBs好氧降解菌株研宄主要是以联苯作为生长底物进行驯化筛选，再测试其降解PCBs的能力。另外，在好氧条件下，某些联苯降解菌通过bph途径共代谢PCB同系物。现今已有较多PCBs降解菌的报道，包括革兰氏阴性菌:Alcaligenes、Janibacter> Acinetobacter> Acidovorax、Cupriavidus、Comamonas、Enterobacter、Sphingomonas、Ralstonia、Burkholderia、Paenibacillus、Pseudomonas> Achromobacter 和革兰氏阳性菌:Rhodococcus、Arthrobacter、Nocardia、Bacillus、Micrococcus、Corynebacterium 等。虽然关于 PCBs 的微生物降解已投入大量的研宄工作，但大多仍限于实验室研宄阶段，PCBs高效降解功能菌种资源匮乏成为其推广应用的最大瓶颈。因此，如何从作为自然环境中绝大部分微生物资源的VBNC菌群中，寻找潜在联苯和PCBs降解菌群，提高菌株的降解效能成为打破微生物修复技术在PCBs污染环境中应用瓶颈的关键所在。
[0006]综上所述，利用促进剂SRpf分离筛选PCBs污染环境中的非可培养状态菌群，可为寻找高效PCBs降解菌及新的菌种资源提供新的途径。另外，该VBNC状态菌的筛选方法亦可用于筛选其它有机污染物降解菌群，为探索新的菌种资源及环境功能菌，提供一种安全、廉价、高效的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有PCBs污染环境的微生物修复技术中存在的菌种分离难、降解效能低、高效降解菌匮乏的不足，提供一种VBNC联苯降解菌的筛选方法及其应用。菌株TG9是依据本发明所述筛选方法获得的多氯联苯降解菌之一，该菌能降解高浓度的联苯，亦可降解低氯代多氯联苯及低氯代苯甲酸。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种VBNC联苯降解菌的分离筛选方法，包括以下步骤:
[0009](I)将藤黄球菌接种于LMM液体培养基，使其培养液OD6tltolS 0.05-0.2 ；LMM液体培养基组成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的 KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02g/L的 L-蛋氨酸，0.04g/L 的维生素 BI，0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L的矿质盐溶液，pH为6.5-8.0 ;培养24_36h，获得种子培养液；
[0010](2)将步骤⑴获得的种子培养液按3-5% (v/v)的接种量接种至LMM液体培养基中，160r/min，培养48_60h，将发酵液离心(8000-10000r/min) 10-15min去除菌体，经0.22 μπι过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为23.96-25.34mg/L，保存于-20°C条件下备用；
[0011](3)制备处理组和对照组的筛选培养基；将步骤(2)得到的促进剂SRpf按体积分数为5-10%添加至无机盐培养基中获得处理组培养基；对照组培养基为不添加促进剂SRpf的无机盐培养基；其中无机盐培养基的组成是:l_2g/L的KH2PO4, 2.5-3.5g/L的K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4,0.02g/L 的 FeSO4.7H20，lg/L 的 NaCl，2_4g/L 的(NH4)2SO4,0.0 lg/L的CaCl2，2mL/L的微量盐溶液，无机盐培养基的pH为7.3-7.5 ;所述微量盐溶液的组成为:4mg/L 的 MoO3, 28mg/L 的 ZnSO4.5Η20，0.02mg/L 的 CuSO4.5Η20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20，溶剂为水；
[0012](4)从受PCBs长期污染的区域采集污染底泥样，取底泥样分别接种至步骤(3)中配制的两种刷选培养基中，得到两个培养体系；其中，PCBs污染底泥与筛选培养基的质量体积比为46-72g/L ；
[0013](5)将联苯分别加入步骤(4)中所述的培养体系中进行连续传代富集驯化，联苯在培养体系中的溶度为500-2000mg/L ； 180-200r/min摇床培养，每代培养时间为3_5d，传代培养3-4次，得到两组富集培养液；
[0014](6)将步骤(5)中所得的两组富集培养液分别稀释，涂布于琼脂平板，并喷洒联苯，挑取能使琼脂平板上出现透明圈的菌落划线纯化，得到纯菌株，经形态特征及16S rRNA基因序列比对分析，获得处理组特有的菌株，即为处于VBNC状态的联苯降解菌；
[0015](7)将步骤(6)获得的处理组特有的菌株进行16S rRNA基因序列及表型、化学特征比对分析，获得新种菌株TG9 ;所述菌株TG9保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC 1.12975，分类命名为:红球菌(Rhodococcus sp.);菌株 TG9 的 16S rRNA 是 SEQ ID N0.1 所不的基因序列。
[0016]进一步地，所述步骤⑵得到的促进