负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的方法。
【背景技术】
[0002]光动力治疗是采用激光与光动力治疗药物(光敏剂)结合对疾病组织进行特异性杀伤的一种新型治疗手段。激光刺激光动力治疗药物后，周围02转变为单线态氧等活性氧物质，活性氧通过氧化作用杀伤靶细胞。但起主要杀伤作用的单线态氧存活时间短，实现光动力治疗药物的定位作用是光动力治疗研究的重点内容之一，通过载体对其传递是实现该功能的一种方法。
[0003]通常的药物载体主要是使用人工合成的聚合物或天然来源的蛋白质和多糖作为原料，其结构比较简单。但是往往生物相容性差，较易被人体的免疫系统识别并清除，具有体内循环时间短且不易到达病变部位的缺点，这些缺点限制了其推广与应用。
[0004]仿细胞微囊是由细胞膜将囊内空间与囊外空间隔离开来形成的球状物质。利用细胞松弛素b处理哺乳动物细胞，破坏维持细胞形态的肌动蛋白的组装，然后在机械剪切的作用下制备仿细胞微囊。
[0005]仿细胞微囊作为药物载体有诸多优点:由于微囊表面实质是一层类细胞膜结构，因此具有极佳的生物相容性；并且有望降低自体免疫系统的清除作用，具有更好的临床应用价值。洋地黄皂苷是一种表面活性剂，可以提高细胞膜的通透性，使得一些分子量较大的药物分子也可以进入细胞膜微囊内部；同时洋地黄皂苷可以与高浓度的钙离子结合，实现细胞膜的再次封闭。因此，可使用洋地黄皂苷暂时地通透细胞膜，将光动力治疗药物装载入细胞膜微囊中；随后封闭囊壁，实现药物的缓释和保护。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法。
[0007]本发明的负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，包括以下步骤:
1)在培养有人平滑肌细胞的培养盘中加入20μ?浓度为lmg/mL的细胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸盐缓冲液洗数次，胰酶消化收集细胞和细胞膜微囊，离心分离得到细胞膜微囊悬液；
2)取200Pg步骤1)所得的细胞膜微囊加入到1 mL洋地黄皂苷与光动力治疗药物的混合溶液中，混合溶液中洋地黄皂苷浓度为10 Pg/mL，光动力治疗药物的浓度为20-200 μδ/mL ;37°C孵育 1 ?24 h ;
3)在步骤2)的溶液中加入10μ? 0.5 mol/mL氯化钙溶液，37°C下孵育2h ;离心收集微囊，洗涤，得到装载光动力治疗药物的细胞膜微囊。
[0008]本发明中，所说的光动力治疗药物是亚甲基蓝。
[0009]本发明的原理:使用洋地黄皂苷提高细胞膜通透性，利用细胞内外光动力治疗药物的浓度差将药物装入细胞膜微囊，随后使用氯化钙溶液封闭细胞膜。
[0010]本发明的有益效果在于:
本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好，材料来源于天然细胞，具有优越的生物相容性和传递性能；洋地黄皂苷的引入，可暂时增加细胞膜微囊的通透性，实现不能穿透完整细胞膜的药物分子亚甲基蓝的包埋，并调控其包埋量，起到保护和缓释的作用，该负载光动力治疗药物的细胞膜微囊在671nm的激光照射下，可产生活性氧杀死细胞，有望用于肿瘤或其他疾病的光动力治疗。
【附图说明】
[0011]图1是细胞膜微囊的透射电镜照片，其中(a)为原始的细胞膜微囊，(b)为装载有亚甲基蓝的细胞膜微囊。
[0012]图2是实施例1所得的细胞膜微囊中的亚甲基蓝的释放动力学曲线。
[0013]图3是实施例2所得的细胞膜微囊中的亚甲基蓝浓度和孵育时间的关系。
[0014]图4是实施例1所得的各负载亚甲基蓝的细胞膜微囊和相同浓度的自由亚甲基蓝对HeLa细胞的暗毒性。
[0015]图5是实施例1所得的各负载亚甲基蓝的细胞膜微囊和相同浓度的自由亚甲基蓝对HeLa细胞的光毒性。
【具体实施方式】
[0016]以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
[0017]实施例1
1)在培养有人平滑肌细胞的培养盘中加入20 μι细胞松弛素b溶液(浓度为1 mg/mL)，37°C下孵育30 min后用磷酸盐缓冲液洗三次，胰酶消化，离心收集细胞；涡旋处理所得细胞1 min ;离心收集所得上清液即为细胞膜微囊悬液。
[0018]2)取200 μg步骤1)所得的细胞膜微囊加入到洋地黄皂苷与亚甲基蓝的混合溶液中，使混合溶液中洋地黄皂苷的浓度为10 Pg/mL，亚甲基蓝的浓度为200 Pg/mL，37°C孵育24 h 。
[0019]3)加入氯化钙溶液，使钙离子浓度为5 mmol/L, 37°C下孵育2h ;离心磷酸盐缓冲液洗数次，得到装载亚甲基蓝的细胞膜微囊。
[0020]将1 mg上述所得的细胞膜微囊分散在1 mL的含有2.5%的戊二醛的磷酸盐缓冲液中固定24 h ;乙醇梯度脱水后包埋到环氧树脂中，用超薄切片机切片，醋酸铀染色，在透射电镜下观察原始的细胞膜微囊(图la)和装载有亚甲基蓝的细胞膜微囊(图lb)。
[0021]将1 mg上述所得的负载亚甲基蓝的细胞膜微囊分散在1 mL磷酸盐缓冲液中，间隔1 h、6 h、12 h和24 h离心收集细胞膜微囊，检测上清液中664 nm处的吸光度得到亚甲基蓝的释放曲线(图2)。
[0022]实施例2
1)在培养有人平滑肌细胞的培养盘中加入20 μι细胞松弛素b溶液(浓度为1 mg/mL)，37°C下孵育30 min后用磷酸盐缓冲液洗三次，胰酶消化，离心收集细胞；涡旋处理所得细胞1 min ;离心收集所得上清液即为细胞膜微囊悬液。
[0023]2)取200 μg步骤1)所得的细胞膜微囊加入到洋地黄皂苷与亚甲基蓝的混合溶液中，使混合溶液中洋地黄皂苷的浓度为10 Pg/mL，亚甲基蓝的浓度为200 Pg/mL，37°C分别孵育 1 h、6 h、12 h、24 h。
[0024]3)在步骤2)孵育不同时间的溶液中分别加入氯化钙溶液，使钙离子浓度为5mmol/L，37°C下孵育2h ;离心磷酸盐缓冲液洗数次，得到各孵育不同时间装载亚甲基蓝的细胞膜微囊。
[0025]根据紫外光谱图中664 nm处的吸光度得到不同孵育时间(步骤2)下该微囊中的药物浓度，见图3。
[0026]实施例3
同实施例1，区别在于步骤2)中，亚甲基蓝在混合溶液中的浓度为20 Pg/mL。
[0027]实施例4
将实施例1中制备的装载亚甲基蓝的细胞膜微囊和相同浓度的自由的亚甲基蓝分别加入到细胞培养液中，使得亚甲基蓝的浓度在2.5-33.3 μΜ之间。使用此细胞培养液孵育HeLa细胞(人宫颈癌细胞)3.5 h，使用MTT法检测细胞活性(图4)。由图可见将亚甲基蓝包入细胞膜微囊可降低其细胞毒性。
[0028]实施例5
将实施例1中制备的装载亚甲基蓝的细胞膜微囊和相同浓度的自由的亚甲基蓝分别加入到细胞培养液中，使得亚甲基蓝的浓度在2.5-33.3 μΜ之间。使用此细胞培养液孵育HeLa细胞(人宫颈癌细胞)30 min，随即用671 nm的激光以lOJ/cm2的强度照射100 s，继续在37 °C下培养细胞3.5 h，使用MTT法检测细胞活性(图5)。由图可见将亚甲基蓝包入细胞膜微囊后仍具有明显的光动力治疗能力，可在适当的光照条件下杀死细胞。
【主权项】
1.负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，包括以下步骤: 1)在培养有人平滑肌细胞的培养盘中加入20μ?浓度为lmg/mL的细胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸盐缓冲液洗数次，胰酶消化收集细胞和细胞膜微囊，离心分离得到细胞膜微囊悬液； 2)取200μg步骤1)所得的细胞膜微囊加入到lmL洋地黄皂苷与光动力治疗药物的混合溶液中，混合溶液中洋地黄皂苷浓度为10 Pg/mL，光动力治疗药物的浓度为20-200 μδ/mL ;37°C孵育 1 ?24h ; 3)在步骤2)的溶液中加入ΙΟμ?0.5mol/mL氯化钙溶液，37°C下孵育2h ;离心收集微囊，洗涤，得到装载光动力治疗药物的细胞膜微囊。2.根据权利要求1所述的负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，其特征在于所述的光动力治疗药物是亚甲基蓝。
【专利摘要】本发明公开的负载光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，步骤包括：选用人平滑肌细胞作为原料制备细胞膜微囊；将得到的细胞膜微囊浸泡在洋地黄皂苷与光动力治疗药物的混合溶液中；使用钙离子封闭细胞膜，得到装载光动力治疗药物的细胞膜微囊。该负载光动力治疗药物的细胞膜微囊在671nm的激光照射下，可产生活性氧杀死细胞，有望用于肿瘤或其他疾病的光动力治疗。本发明制备方法简便可控，生产效率高，有良好的应用前景。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/5415, A61K47/28, A61K41/00, A61K9/50, A61K47/46
【公开号】CN105311632
【申请号】CN201510704859
【发明人】毛峥伟, 韩利杰, 高长有
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月27日