专利名称：一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一 种利用囊膜病毒出芽特性分离获得细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法。
背景技术：
生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细 胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋 白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为 药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白 研究的"瓶颈"。
本发明提供一种膜蛋白分离与纯化新的技术方法。利用杆状病毒出芽特 性，导致宿主细胞膜破裂，然后分离出细胞膜成分。杆状病毒具有限制性，只
能感染昆虫细胞。然而，1995年，Hofmann等研究发现在杆状病毒DNA中插入 CMV(human cytomegalovirus immediate-early region)后，杆状病毒可以在人 肝细胞中表达。1997年，Barsoum等研究报道，在杆状病毒DNA中插入VSV-G (vesicular stomatitis virus G protein)能扩大宿主范围并增加转染率。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种细胞膜和细胞器膜蛋白分离与 纯化新的技术方法。
本发明的一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，通过重组杆状病 毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜
破裂，细胞膜碎片疏水作用会形成膜小球，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞 器膜蛋白。
制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，具体包括以下步骤
(1 )重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染动物宿主细胞，37°C、 5 %0)2条件下培养5—6天，用PBS冲洗细胞，收获动物细胞并超声破碎；
(2)将上述破碎液经12000rpm离心20 — 60min，膜碎片或膜小球沉淀； 上清液进行超速离心，35000rpm， 30—60min，去除病毒粒子；收集12000rpm 离心的沉淀和35000rpm离心的上清液，沉淀用PBS重悬溶解；
(3 )将12000rpm离心沉淀的重悬液及35000rpm离心的上清液，用截留 分子量为750kD的中空纤维膜超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋白。
所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法在pFastBac 载体中插入 CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac(E)系统获得BacmidCMV-G-HA。
所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤
(1) 融合基因HA与质粒pFastBacT"同时进行EcoR I和Xho I双酶切，在 T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM质粒中，转化到感受态细 胞E.coli DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒 pFastBac-HA;
(2) 通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序 歹!j，含BamH I位点的上幼,弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I 位点的下游引物gcgaattcgacggatccttatcactttc, PCR反应结束后，电泳，纯 化回收反应产物；
(3) 步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别 进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒 pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和 测序鉴定正确插入的重组质粒pFastBacCMV-G-HA;
(4) 根据Bac-to-Bac 系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒 pFastBacCMV-G-HA转化到DH10BacTM感受态细胞中，平板于37'C培养24-48h后 挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天，挑 取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒BacmidCMV-G-HA;
(5) 取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入lOOul Sf-900 II SFM，取cellfectin 试剂加入到lOOul的Sf-900 II SFM，再将两者混匀，室温放置15-30min， Sf9培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细胞 转移到27。C至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上述 的DNA混合物，27"C培养5h。移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27°C 培养72h，收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。 所述的融合基因HA的构建包括以下步骤
(1) 以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽基因，PCR所用的两种引
物为
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，
Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3，；
(2) 以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域基因，PCR所用的两种引
物为
Ptml: 5' cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3' Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3';
(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列为模板，扩增HA基因，PCR所用的两 种引物为
Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3';
(4) 以gp64信号肽基因和HA基因为模板，利用PCR方法扩增出sp-HA融 合基因序列，PCR所用的两种引物为
Pspl: 5' gcgaattcatgctactagtaaatcag 3' Pha2: 5' atgcaaattctgcattgtaa 3'
(5) 以融合基因印-HA与gp64跨膜域基因为模板，构建出HA融合基因， PCR所用的两种引物为
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。 所述的DH10BacTM感受态细胞含Bacmid质粒。
步骤(4)所述的平板含Bluo-gal，卡那霉素、庆大霉素、四环素、 IPTG。
步骤(4)所述的液体培养基含卡那霉素、庆大霉素、四环素。 步骤(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素为青霉素和链霉素。
本发明的有益之处在于本发明构建了 BacmidCMV-G-HA重组杆状病毒，感 染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位于宿主的细胞膜上， 以HA为膜蛋白上的一个标志，在分离纯化中通过检测HA活性追踪细胞膜。当 病毒大量出芽后，导致宿主细胞的细胞膜破裂，破碎的细胞膜因疏水作用而形 成"球状"，因此称之为膜小球。由于蛋白的相互作用，细胞膜上可能会带有 细胞器的成分，因而也获得了细胞器的膜成分，反复冻融使细胞器的膜破裂。 再对膜成分进行高效液相色谱(HPLC)和质谱分析，从而鉴定并获得膜蛋白。 膜蛋白质的研究一直是蛋白质组学研究的瓶颈，本发明主要针对膜蛋白，能促 进膜蛋白组学研究的发展，有助于发现药物蛋白作用的靶点，促进药物学、医 学的发展。
具体实施例方式
本发明的目的是提供一种新的膜蛋白分离纯化的技术方法，通过重组杆状 病毒感染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位于宿主的细胞 膜上，以HA为膜蛋白上的一个标志，有HA活性则表明有细胞膜成分存在。当 病毒大量出芽后，导致宿主细胞的细胞膜破裂，膜碎片形成膜小球。分离出宿 主细胞膜小球，由于蛋白的相互作用，细胞膜小球上可能会带有细胞器的成 分。再对膜"小球，，成分进行HPLC和质谱分析，从而鉴定并获得膜蛋白。
为了能时杆状病毒能感染动物细胞，本发明构建了 BacmidCMV-G-HA重组杆
状病毒，通过从质粒pHCMV-VSV-G中扩增出CMV-VSV-G的序列，同时构建出HA
融合基因(在HA基因的N端与C端分别连接上信号肽和跨膜区)，再分别将两
者插入到pFastBacT"载体中，形成pFastBacCMV-G-HA质粒，根据Bac-to-Bac
杆状病毒表达系统而获得BacmidCMV-G-HA重组杆状病毒。
下面结合实施例来说明本发明的技术方案 实施例1
HA基因的作用相当于一个分子标记，在此发明中HA可以用其他的基因或标 记物代替，如绿色荧光蛋白GFP，本发明仅以HA基因为例，但这些实施例并不 用于限定本发明。
1、融合基因HA的构建
在HA基因(Genbank DQ520855)的5，和3'端分别连接编码杆状病毒囊 膜蛋白gp64信号肽基因序列和gp64跨膜区基因序列，并在融合基因的5'和 3，端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点。分别以杆状病毒(AcNPV)囊膜糖蛋 白(gp64)信号肽基因序列(Genbank号NP 074525)、禽流感病毒H5N1 HA基 因序列(禽流感病毒H5N1杭州流行株，Genbank DQ520855)和AcNPV gp64跨 膜区基因序列(Genbank号NP 074525)为模板设计3对引物，首先扩增目的片 段gp64信号肽(以下简称sp) 、 HA和gp64跨膜域(以下简称tm)，然后 利用各目的片段互为引物和模板合成融合基因HA。设计引物如下
Pspl5，gcgaattcatgctactagtaaatcag 3'
Psp25，tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3'
Phal5，aaagaacgttactgttacac 3'
Pha25，atgcaaattctgcattgtaa 3'
Ptml5，cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3'
Ptm25，gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3'
(1) gp64信号肽(sp)的扩增
以gp64 DNA (Genbank号NP 074525)为模板，进行PCR反应，先94。C预 变性3min，然后进行30个循环，其循环条件为94'C变性30s， 68。C复性延伸 30s;循环结束后，再68'C延伸5min。
在一个无菌的0. 5ml离心管中，混合下列成分
10XPCR Buffer 1
25mrno1 MgC12 8 u 1
2. 5 ,1 dNTPs 8 u 1
Pspl 1u1
Psp2 1 ii 1
模板 1 u 1K0D-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本) 1 ii 1 加无菌双蒸水至100 Hi
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结 束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(2) gp64跨膜域(tm)的扩增
以gp64 DNA为模板，进行PCR反应，先94。C预变性3min，然后进行30个 循环，其循环条件为94"C变性30s， 68。C复性延伸30s;循环结束后，再68'C 延伸5min。
100ul的反应体系同上，所用引物为Ptml和Ptm2 ，各组分混匀后，放入 PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断， 同时切胶回收目的片断。
(3) HA基因的扩增
以禽流感病毒H5N1 HA基因序列(从患病鸡血清中提取，序列见Genbank DQ520855)为模板，进行PCR反应，先94"预变性3min，然后进行30个循 环，其循环条件为94"变性30s， 68匸复性延伸lmin;循环结束后，再68°C 延伸7min。在一个无菌的0. 5ml离心管中，混合下列成分10XPCR BufferlO ul， 25mmo1 MgC12 8ul， 2.5 ramol dNTPs 8ul，引物Phal lul，引物Pha2 bl，模板lul， KOD-Plus DNA聚合酶lul，加无菌双蒸水至100 " 1。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应 结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(4) gp64信号肽sp基因与HA基因的融合
进行PCR反应，先94'C预变性5min，然后进行30个循环，其循环条件 为94'C变性30s， 68。C复性延伸lmin;循环结束后，再68°。延伸7min。在一 个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10 X PCR Buf f er10 u 1 ， 25mmo1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8p1，引物Pspl lul，引物Pha2 lul，模板 sp 模板HA liU， KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO，日本)lnl，加无
菌双蒸水至100 u 1。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应 结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
因为sp的下游引物Psp2设计时加入了 HA基因5'端的部分序列，所以 PCR扩增出的sp片断3'端序列与HA基因5，端序列存在重叠，再次利用PCR 方法就可以扩增出sp-HA融合基因序列。
(5)融合基因sp-HA再次与tm的融合，构建出HA融合基因
PCR反应参数为94'C预变性5min,然后进行30个循环，其循环条件为94 t:变性30s， 68。C复性延伸1.5min;循环结束后，再68°(3延伸10min。在一个 无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10XPCR BufferlOul， 25画1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ul，引物Pspl liU，引物Ptm2 lul，模板sp-HA 1 ul，模板tm lul， KOD-Plus DNA聚合酶lul，加无菌双蒸水至100u 1。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应 结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
同上，因为tm的上游引物Ptml设计时加入了 HA基因3'端的部分序列， 所以PCR扩增出的tm片断5'端序列与HA基因3'端序列存在重叠，再次利用 PCR方法就可以扩增出融合基因HA。
2. 构建pFastBac-HA质粒
上述得到的融合基因HA与质粒pFastBac (invitrogen公司Bac-to-Bac baculovirus expression system[kits])同时进行EcoR I禾口 Xho I双 酶切，在T4连接酶(TAKARA公司试剂盒，按说明书操作进行)的作用下使HA 融合基因插入到pFastBac 质粒中。根据kits中说明书操作，转化到感受态细 胞E. coli DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒 pFastBac-HA。
3. 构建pFastBacCMV-G-HA质粒
通过pHCMV-VSV-G (Genebank NO. AJ318514)的序列设计一对PCR引物， 扩增出CMV-VSV-G的序列。上游引物(含BamH I位点) atggatccgagcttggcccattgcatac ， 下坊,弓|物(含 EcoR I 位点) gcgaattcgacggatccttatcactttc。 PCR程序设计如下94。C预变性7min， 94°C 变性lmin， 68。C复性延伸3min， 30个循环，68。C延伸10min。在一个无菌的 0.5ml离心管中，混合下列成分10XPCR Buffer 10u 1， 25國1 MgC12 8ul，
2.5 mmol dNTPs 8ul，引物各3ul，质粒模板lul， K0D-Plus DNA聚合酶1 ul，加无菌双蒸水至100"1。
PCR反应结束后，电泳，纯化回收反应产物。
纯化的PCR产物与质粒pFastBac-HA分别进行BamH I和EcoR I双酶切， 在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒pFastBac-HA中。转化至感受态细 胞E.coli DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和测序鉴定正确插入的重组质 粒pFastBacCMV-G-HA。
4. 杆状病毒表达质粒BacmidCMV-G-HA
根据Bac_to-Bac baculovirus expression system操作说明书进行，取 5ul (约lng)重组质粒pFastBacCMV-G-HA转化到DHlOBac 感受态细胞(含 Bacmid质粒)中，平板(含Bluo-gal，卡那霉素，庆大霉素，四环素，IPTG) 于37。C培养24-48h后挑取白色克隆。划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳
性克隆。第二天，挑取单菌落接种于液体培养基(含上述三种抗生素)中培 养，用来分离重组Bacmid质粒，根据说明书的操作而获得重组质粒BacmidCMV-G-HA。 PCR鉴定重组质粒序列正确。
5. 含重组质粒的重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA的获得 根据操作说明书进行，取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入
lOOul Sf-900 II SFM (不含抗生素，invitrogen)，取cellfectin 试剂 (invitrogen)加入到腦ul的Sf-900 II SFM (不含抗生素)，再将两者混 匀，室温放置15-30min。 Sf9 (9X 105cells/35mm well)培养在含50个单位的 青霉素和链霉素的SFM中，将细胞转移到27'C至少放置lh，再用不含抗生素的 SFM培养基洗涤两次后，加入上述的DNA混合物，27'C培养5h。用移液器移去 DNA混合物，加入SFM (含青霉素和链霉素)，于27"C培养72h。收获细胞，获 得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。
6. 重组杆状病毒感染小鼠肝细胞
此重组杆状病毒可以感染哺乳类动物细胞，本发明以小鼠肝细胞为例。 重组杆状病毒以5M0I感染小鼠肝细胞(购于上海麦莎生物)，37°C、 5% C02条件下培养5_6天，PBS冲洗，收获细胞，并超声破碎细胞。 6.膜蛋白的分离
将上述细胞破碎液经12000rpm离心35min，膜碎片或膜小球沉淀；上清液 进行超速离心，35000rpm， 45min，去除病毒粒子；收集12000rpm离心的沉淀 和35000rpm离心的上清液，沉淀用PBS重悬溶解；
8. 超滤
12000rpm离心沉淀的重悬液和35000rpm离心的上清，用截留分子量为 750kD的中空纤维膜(美国GE公司)进行超滤，得到细胞膜及细胞器的膜蛋 白。截留液用于HPLC分析。超滤器的操作根据说明书进行， 一定要清洗中空纤 维膜。
9. HA活性检测
截留的样品进行测活，测活方法采用红细胞凝集试验。取24孔细胞培养 板，在每一排的1到6孔(Al-A6)加250 u 1生理盐水(0. 85%)后，加入250 ul样品于第一孔，做倍比稀释，同时设置阴性对照孔，加入不含样品的液体做 倍比稀释，再加入1%鸡红细胞悬液250ul至每一孔内，轻轻震荡培养板，于 37"C孵育4小时后观察结果。结果显示是阳性，说明HA融合蛋白使定位于膜上 的，否则HA将会滤出纤维膜。
10. HPLC与Q-Trap LC-MS/MS质谱分析膜成分
在750kD超滤的样品中，由于蛋白之间的相互作用，细胞膜蛋白可能与细 胞器的膜蛋白粘连在一起，为了使细胞器的膜蛋白破裂，将截留样品在液氮和 +37°〇之间反复冻融3-5次，使膜破裂。12000rpm，离心20-60min，使大片的膜 沉淀下来，用于后面的HPLC分析。上清液也用于HPLC分析。
12000rpm沉淀部分用20%乙腈反复溶解后，取上清，用于HPLC上样， 0. 5ml/管收集样品。
12000rpm上清液溶解于5%乙腈(acetonitrile)， 直接上样于HPLC，按 0. 5ml/管收集样品。
收集的样品用质谱级胰酶(trypsin,购于sigma)进行酶解，于37。C反应 过夜。酶解后的肽段样品再进行HPLC分析，按峰或按管收集样品，用于质谱分 析。
经HPLC分析的样品进行Q-Tr邻LC-MS/MS (美国ABI公司)质谱分析，得 到蛋白的可能氨基酸序列，用于数据库比对。 11.数据检索
质谱所测得的可能性氨基酸序列在NCBI蛋白数据库中进行检索，同时通过 NPS@提供的跨膜区域分析软件及TMH薩服务器 (http:〃www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)对检索到的蛋白进行跨膜分析，分 析结果发现，约80%的蛋白为膜蛋白，具有跨膜区。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
序列表
SEQ ID NO 1:
28 atggatccga gcttggccca ttgcatac SEQ ID NO 2:
28 gcgaattcga cggatcctta tcactttc SEQ ID NO 3:
26 gcgaattcat gctactagta aatcag SEQ ID NO 4:
44 tgtgt犯cag taacgttctt ttccgc犯ag gcageiatgcg ccgc SEQ ID NO 5:
45 cgttacaMg cagaatttgc attggtgata ctgggctatc caaaa SEQ ID NO 6:
30 gtgagctctt actttccaag tcggttcatc SEQ ID NO 7:
20 aaagaacgtt actgttacac SEQ ID NO 8:
20 atgcaaattc tgcattgtaa
权利要求
1、一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于通过重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，细胞膜碎片疏水作用会形成膜小球，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。
2、 根据权利要求l所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其 特征依次包括以下步骤(1 )重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染动物宿主细胞，37°C、 5 %0)2条件下培养5—6天，用PBS冲洗细胞，收获动物细胞并超声破碎；(2) 将上述破碎液经12000rpm离心20 — 60min，膜碎片或膜小球沉淀； 上清液进行超速离心，35000rpm， 30—60min，去除病毒粒子；收集12000rpm 离心的沉淀和35000rpm离心的上清液，沉淀用PBS重悬溶解；(3) 将12000rpm离心沉淀的重悬液及35000rpm离心的上清液，用截留 分子量为750kD的中空纤维膜超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋白。
3 、根据权利要求1或2所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法， 其特征在于所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法在pFastBac 载 体中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac 系统获得 BacmidCMV-G-HA。
4、根据权利要求3所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其 特征在于所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤(1) 融合基因HA与质粒pFastBacTM同时进行EcoRI和Xho I双酶切，在 T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBac「M质粒中，转化到感受态细 胞E.coli DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒 pFastBac-HA;(2) 通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序 列，含BamH I位点的上游弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I 位点的下游引物gcgaattcgacggatccttatcactttc， PCR反应结束后，电泳， 纯化回收反应产物；(3) 步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别 进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒 pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和 测序鉴定正确插入的重组质粒PFastBacCMV-G-HA;(4) 根据Bac-to-Bac 系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒 pFastBacCMV-G-HA转化到DH10BacTM感受态细胞中，平板于37。C培养24-48h 后挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天， 挑取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒BacmidCMV-G-HA;(5) 取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入100ul Sf-900 II SFM， 取cellfectin 试剂加入到100ul的Sf-900 II SFM，再将两者混匀，室温放 置15-30min， Sf9培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细胞转移 到27。C至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上述的 DNA混合物，27"C培养5h。移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27'C培 养72h，收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。
5、根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其 特征在于所述的融合基因HA的构建包括以下步骤(1) 以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽基因，PCR所用的两种引物为Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，Psp2: 5' tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3';(2) 以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域基因，PCR所用的两种引物为Ptml: 5' cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3' Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3';(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列为模板，扩增HA基因，PCR所用的两种引物为Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3';(4) 以gp64信号肽基因和HA基因为模板，利用PCR方法扩增出sp-HA 融合基因序列，PCR所用的两种引物为Pspl: 5' gcgaattcatgctactagtaaatcag 3' Pha2: 5' atgcaaattctgcattgtaa 3';(5) 以融合基因sp-HA与gp64跨膜域基因为模板，构建出HA融合基因， PCR所用的两种引物为Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。
6、 根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其 特征在于步骤(4)所述的DH10BacTM感受态细胞含Bacmid质粒。
7、 根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其 特征在于步骤(4 )所述的平板含Bluo-gal，卡那霉素、庆大霉素、四环素、 IPTG。
8、 根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其 特征在于步骤(4 )所述的液体培养基含卡那霉素、庆大霉素、四环素。
9、 根据权利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法， 其特征在于步骤(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素为青霉素和链 霉素。
全文摘要
本发明公开了一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，通过重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，细胞膜碎片疏水作用会形成膜小球，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明的有益之处在于本发明构建了BacmidCMV-G-HA重组杆状病毒，感染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位于宿主的细胞膜上，当病毒大量出芽后，导致宿主细胞的细胞膜破裂，形成膜小球，由于蛋白的相互作用，也获得了细胞器的膜成分，反复冻融使细胞器的膜破裂，再对膜成分进行高效液相色谱(HPLC)和质谱分析，从而鉴定并获得膜蛋白。
文档编号C07K14/435GK101348801SQ20081006133
公开日2009年1月21日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者吕正兵, 吴祥甫, 张耀洲, 健 陈 申请人:浙江理工大学