专利名称：红细胞分类计数的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液样品中红细胞分析，特别是涉及对血液样品中红细胞密度亚群进行群体频率分布分析的方法及用具，这一分析方法可反映早至120天前的病人血液中红细胞的历史形成和/或丧失情况。
目前，一般是通过检测病人血液中的血细胞比容计数来监测病人血液中代表净产生量减少的红细胞浓度。血细胞比容是压紧的红血细胞在离心的全血样品中所占有的百分体积。目前血细胞比容测定可经下列步骤完成用抗凝全血充满小口径玻璃管，封闭管的一端，然后离心该管以压紧红血细胞。压紧后，约经3-5分钟测量压紧之红血细胞柱的长度和总充入长度，并作为压积红细胞的长度比例计算出血细胞比容。血细胞比容测定并不能给出关于红细胞产生和/或丧失的信息。
美国专利4，027，660、4，181，609、4，156，570、4，558，947及其它专利中描述了另外一种方法，其中包括将抗凝全血样品吸入毛细管内，在充有血液样品的管内放一个浮片，离心该血液样品以使浮片固定在红细胞层中，并使血沉棕黄层成分分类计数得以检测。该技术也被用于借助校正因数进行的血细胞比容检测，其中使用校正因数在于校正浮体沉入压紧的红细胞造成的偏差，并可校正因在血液样品中加入添加剂如草酸钾造成的偏差。血细胞比容计数是一种检测在进行检测当时的血液红细胞计数的可靠方法，但该方法不可能检测某些与新红细胞产生或红细胞丧失有关的条件。如果血细胞比容低，内科医生即警觉到这样的事实，即病人目前的病理状况或者是抑制新红血细胞生成，或者是发生了非典型的红血细胞丧失，或者是目前正存在不能产生足够红细胞的情况。然而，血细胞比容检测法通常不能确定这些非典型状况，除非它们是在读出血细胞比容时相对同时存在的。因此，例如病人在检测血细胞比容前三周有过出血史，这一血液检测试验便不一定显示这一经历，因为失血可能已引起红细胞产生量增加，以补偿出血造成的后果。
1日龄红细胞保留了当用新亚甲兰染色时使之显现为网织红细胞的核酸片段。经染色红血细胞的涂片，然后手工计算显示为网织红细胞之红细胞的百分数，即可估计出目前红细胞产生率。另外，可用商品着色剂染色来计数血液样品中的网织红细胞，其中用荧光活化的细胞分类器(FACS)检测并计数细胞。正常染色和涂片方法以及FACS均不能检测例如为正常产生速率5倍的红细胞产生速率;其可持续3天，并在采集血样前10天出现的增加了的产生率。这些现有方法只能在特定过程期间或其后1天检测增加或降低的红细胞产生情况。
L.M.Corash等人(J.ofClinicalMedicine，July，1974)描述了基于简化的密度梯度按照细胞日龄分离红细胞的方法。该文献指出，可用多种已知的细胞支持物质完成红细胞的日龄依赖性分离;细胞支持物质如牛血清白蛋白、邻苯二甲酸酯、葡聚糖及阿拉伯树胶。该文献提到这些现有方法并不符合要求，提示可使用30，000道尔顿的阿拉伯半乳聚糖多糖代替已知的支持物质。然后Corash等人的方法需要使用除去纤维蛋白的、洗过的并压紧的人红细胞，并将其铺敷在预形成的介质梯度上。
须在含有压紧之细胞和介质的离心管内充入矿物油，然后再离心分离细胞。因此Corash等人的方法费时而且操作复杂。
本发明涉及进行红血细胞分析的方法和用具，其可对全血样品中红细胞的密度亚群进行群体频率分布分析，该分析法可揭示在进行样品分析时或前两天以至在进行分析前多达大约120天期间内发生的红细胞产生增加和/或减少情况，而这些是不能按照现有技术用血细胞比容和网织红细胞测定法揭示的。
在体内，红细胞是以密度亚群的连续梯度存在的，最年轻的细胞最轻。这一现象部分原因是由于伴随红细胞老化，细胞钾和水含量的缓慢和进行性丧失。总红细胞群体的比重范围约为1.050至1.150;当样品中存在红细胞增浓剂时，或可增高10%。
本发明利用了引入离心管内的不同密度标志物，以根据它们的比重各密度来描绘红细胞群体的亚群。因此有可能进行历史性红细胞分析，借以作为追踪试验前长达120天的时间内红细胞正常和异常产生(或丧失)的指征。
标志物可以是塑料珠、乳胶球或脂质体等，其包括具同一功能不同组，各组中的小珠或小球标志物成分具有在前述红细胞比重范围内精确限定的比重，并且标志物的比重在各组间均不同。最好有5至20个不同的标志物组，且各组间均匀分配比重间隔。因此，对于有20个标志物组的实施方案，标志物比重梯度为1.050，至1.055，至1.060等，以0.005的间隔依此类推直到1.150;或者当血液样品中存在增浓剂时这一范围可高10%。可先形成有不同密度或比重的不同塑料或其它原料的溶液，借以制得标志物。当与待检样品中的血细胞或血浆相互作用时，标志物将不会改变其密度或比重。
当血液样品在管内被离心时，不同组的标志物将在红细胞群体亚群的近似介面上沉淀出来，从而可检测各细胞亚群的长度并转变成红细胞密度亚群的定量数据。当测得值转化为直方图时，将会鉴定出试验前存在的任何异常红细胞产生和丧失。如果在试验前整个靶时间内红细胞产生和丧失活动都是正常的，此时各红细胞亚群层和带从红细胞层顶部到底部将具有基本上相等的长度，同时随着细胞日龄增加，因生理性血液丧失而可见带的长度有明显的渐进性缩短。如果在靶时间以前即发生了异常红细胞产生或丧失，则带长度将根据情况表现较短或较长。
如果红细胞产生增多的时间是以大约为正常生理速率3倍(或其它倍数)的速率发生的，则在离心的血液样品中受影响的红细胞亚群将出现细胞大小的增加。例如，红细胞亚群被限制在10天期间的细胞，并且如果增加的产生以三倍于正常产生速度的三倍速率，在10天亚群期间内存在5天(以及如果在亚群仍存在于样品中的时间内抽除样品)，则亚群的长度将是正常预期长度的两倍。现借助10天期间的下列方案解释上述内容，在此期间正常红血细胞产生已有5天，并存在高三倍的红细胞异常产生。假定在10天期间的任何5天内存在3倍正常“单位”红细胞产生。在此期间内，产生了15(3×5)“单位”的红血细胞。其它5天，则产生了5“单位”红血细胞(5天中每天1“单位”)。总共10天期间可以想见产生了10“单位”，但在前述的异常产生期间，将总共产生20“单位”。因此，异常高的红细胞产生将在离心的红细胞压积中呈现异常较长的亚群。
很显然，如果出现降低红血细胞产生的期间，则亚群红细胞带长度同样比预期的短。
在因出血所致的延长失血期间，出血期间产生的所有红细胞亚群均以同样的比例降低。
因此本发明的一个目的是提供一种通过密度检测抗凝全血样品中红血细胞亚群的改进技术。
本发明的另一个目的是提供一种特征性描述的技术，其中红血细胞在透明管内被离心成不同的层，并在红细胞层内分成可见的亚群。
本发明的另一个目的是提供一种特征性描述的技术，其中红血细胞亚群因向血液样品中加入标志物而呈现高亮度，所说的标志物包括具有同一功能的不同组，各组均具有准确限定且不同的密度或比重。
本发明的再一个目的是提供一种特征性描述的技术，其中标志物是在红细胞层中形成准确限定线的小珠，借助划定根据比重区分的红血细胞亚群。
根据下文结合附图对本发明优选实施方案所作的详细描述，本发明的这些和其它目的以及优点将会更为清楚。
图1是用于完成本发明之方法的离心管的正视图。
图2是显示离心之血液样品的图1离心管的细节，其中放大了红血细胞层或增大了体积以特别指出本发明的特征。
图3是用于完成本发明之离心管的第二个实施方案的纵剖面图。
图4显示用计算机化读出仪制得的离心之血液样品红细胞的扫描图。
图5是由扫描得到的细胞亚群层厚度信息打印之条线图的一般化图解显示。
图6和7是显示正常和异常血液产生史的红血细胞亚群长度的条线图。
现在参见图1和2，图1中显示的管2可以是玻璃毛细管或其它透明管，其中含有一个塑料浮片或插入物，当其与管内血样品一起离心时，其比重可使沸片4通过红血细胞沉到管2的底部6处。不同比重的各组塑料珠可被分配在管2内的集束5中。塑料帽10封闭管2的底部6。
将血液样品抽入管2中并在其中随浮片4和小珠5一起离心。小珠簇5分散于血液样品中并沉入不同的带在红细胞层中形成一条线(如图2所示)，而浮片4则沉入并通过红细胞R。
白细胞W层处在各带之外红细胞/白细胞介面Ⅰ的上面。小珠带B按照红细胞的不同比重，即按照其日龄将红细胞层分成不同的红细胞亚群。根据正常红细胞的产生和丧失情况，可看出各红细胞亚群长度从红细胞层的顶部到底部逐渐减小。
图3显示可用于实现本发明的另一种形式的离心管。管12有一个复合的漏斗形膛，包括扩大的开放末端部分14和限制性封闭的末端部分16。膛的大小应使离心的血液样品中的红细胞R沉降到膛的限制部分16中，同时白细胞和血浆则大部分留在膛的扩大部分14中。标志物带B分散于离心的红细胞层中。管12是由透明玻璃或塑料制成的。应指出的是，图3中所示的离心管并不需浮片组分。
离心血液样品后，将样品放在1980年6月24日授权的美国专利4，209，226号或1985年12月17日授权的美国专利4，558，947号(S.C.Wardlaw)中公开类型的仪器中。该仪器可检测各红细胞亚群带，以得到如图4中图解所示的扫描曲线，其中指向下的尖头代表由仪器“看出的”标志物带或线。将扫描图转化为如图5所示的条线图，其中X轴标示根据密度(其反映了细胞日龄)限定的红细胞亚群，且其中Y轴是红细胞柱中分配于X轴细胞密度下的红细胞的百分比。
图6和7是显示正常和异常试验结果的红细胞亚群长度的条线图，试验中记录了一个标志物亚群所代表的标志物亚群每天的变化。各图中给出了各条线图所代表的状况。这些条线图有效地提供了红细胞层的每天的长度变化，揭示了每天红细胞产生和/或丧失的动态情况。
虽然塑料插入物可被描述为“浮片”，但也很容易理解到的是红细胞中不真的需要浮片。塑料插入物应具有足可使之通过至少占绝大部分红细胞如至少占红细胞压积柱之约90%的长度下沉。红细胞亚群层应扩展约1.5至3倍。插入物的长度应足以确保它将通过具有40或较少血细胞比容之血液样品中堆积的红细胞层充分伸展。插入物可形成如图1所示之底部塑料密封帽的一个整合部分。
标志物可包括许多由具有不同密度或比重之塑料制成的圆片;使当使用这样的圆片时，必须根据它们的密度或比重预装入离心管内，最重的圆片最接近管底物，最轻的圆片最接近管顶部。
还应注意的是，本发明方法的时间分辨能力取决于标志物亚群的数目。例如，如图6和7中所示的120个亚群标志物组的时间分辨能力为1天;而在大多数情况下12个亚群标志物组将给出10天的时间分辨能力。事实上，插入物通过红细胞层完全下沉并不会影响用现有技术中所述的适当仪器测定血液样品之血细胞比容的能力。美国专利4，558，947和4，683，579号(两专利均授权于S.C.Wardlaw)中公开了检测血液样品中血细胞比容的仪器。
因为可以在不背离本发明基本概念的前提下对已描述的本发明之实施方案进行许多改动，所以不以待批权利要求以外的其它方式限制本发明。
权利要求
1.对全血样品中红细胞之不同密度亚群进行群体频率分布分析的方法，该方法包括a)提供含有血液样品的透明管，b)在所说的管中提供许多标志物，将这些标志物按照在红细胞比重范围内限定的不同比重分成几组，其中各组标志物的比重均不同于任何其它组标志物的比重，以及c)离心血液和标志物以将血液样品按比重分离成其组分层，并使各组标志物包埋在红细胞层中，从而按照各红细胞亚群中个别细胞的密度将红细胞分成依次排布的不同的细胞亚群层。
2.根据权利要求1的方法，该方法还包括在所说的管内装入一个一般呈圆柱形的插入物，该插入物的比重将使所说的插入物在所说的离心步骤中通过红细胞层沉降。
3.根据权利要求2的方法，该方法还包括检测所说之细胞亚群层的长度，以定量各细胞亚群层中的细胞群体。
4.根据权利要求3的方法，该方法还包括打印所说细胞亚群层长度的条线图的步骤。
5.根据权利要求4的方法，该方法还包括根据所说的条线图确定细胞发育史上异常情况的步骤。
6.根据权利要求1的方法，其中所说的标志物是塑料珠。
7.对全血样品中的红细胞密度群体进行群体频率分布分析的用具，所说的用具包括a)含有血液样品的透明管，以及b)许多标志物，所说的标志物包括几个标志物组，各组都有定在红细胞之比重范围内的比重，且各组中标志物的比重均不同于任何其它组中标志物的比重。
8.根据权利要求7的用具，其中所说的标志物是塑料珠。
9.根据权利要求8的用具，其中所说的塑料珠被分成若干组，各组的比重均与下一个相邻组塑料珠的比重相差0.005。
10.根据权利要求7的用具，其中还包括一个置于所说的管内的一般呈圆柱形的插入物，所说的插入物所具有的比重将使所说的插入物通过在管内离心的全血样品中的红细胞层沉降。
全文摘要
红细胞在体内以连续的细胞亚群密度梯度存在，最年轻的细胞最轻。在含有塑料珠的透明管内离心血液样品，其中选择多组小珠，各组均具有准确限定的并且在红细胞密度范围内分配的不同比重。各组小珠在红细胞层中形成所占空间很窄的带，进而在不同细胞亚群层间形成分界线。然后可检测不同细胞亚群层的长度以对病人血液中的红细胞亚群作出定量分析。
文档编号G01N33/49GK1073263SQ92111088
公开日1993年6月16日 申请日期1992年9月25日 优先权日1991年10月4日
发明者罗伯特·A·莱维, S·C·沃德洛 申请人:罗伯特A·莱维, S·C·沃德洛