一种红细胞破膜方法
【专利摘要】本发明涉及的是一种用于红细胞破膜的方法，其特征在于它包括以下步骤：取适量的人血加入3-6倍体积的生理盐水(0.9％NaCl溶液)，在4℃，2800转的条件下离心，15-30分钟。得到含白细胞，血浆蛋白和血小板的上清液并将其挤出，保留下层压积红细胞，重复上述洗涤过程3-5次以，直至上层清液基本无色，以最大限度除去红细胞以外的其他物质，得到洁净压积红细胞。取一定量的压积红细胞，加入等体积的灭菌高纯去离子水进行5-15分钟的预胀，最后加入2倍体积的水低渗10-20分钟，10000转速下离心30-60分钟，离心后上清液为血红蛋白溶液。
【专利说明】一种红细胞破膜方法
(-)【技术领域】:
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是一种红细胞破膜方法。
(二)【背景技术】:
[0002]以输入全血为主要手段的传统输血方式在医疗救护方面发挥了极为重要的作用，但同时其自身也存在难以克服的各种缺点，主要表现在:输入前需进行交叉配型、存在多种病毒交叉感染的危险、血源紧张、贮存期较短且需要特殊的设施。为了解决上述矛盾，人们早在19世纪末就开始了有关红细胞代用品的研究。红细胞代用品是指具有扩充血容积、维持血管内外渗透压平衡并且有载氧功能，用以代替人红细胞的各种氧载体的总称。血液代用品的研制经历了从最初无载氧功能的血管扩容剂，如:高渗盐溶液、羟乙基淀粉溶液、明胶等到目前具有携氧功能的各种载体溶液。目前正在研制的以血红蛋白为基础各类产品与全血比较具有诸多优点，如:来源广泛、安全洁净、可长期保存、输入人体前无需进行交叉配型，特别适用于战争、自然灾害、以及其他突发事件中大量出血病人的急救。血红蛋白是人体内的物质，它的溶液作为红细胞代用品比化学合成物质更具优越性。
[0003]目前已有5家以血红蛋白为基础的产品完成或接近完成了III期临床研究，取得了明显的进展。然而，这些产品应用于临床时都程度不同地出现了诸如血管收缩、血压升高，心脏、肾脏、肝脏等器官受损等毒副作用。一般来讲，以血红蛋白为基础的产品的来源为血库过期血，将红细胞破膜后释放出血红蛋白，之后对血红蛋白进行纯化、修饰得到制品。在破I吴之后要求纯化血红蛋白中憐脂残留量很低，否则会在后续的动物、临床试验中弓I起不良反应，因此在破膜时要求将血红蛋白尽量释放，但膜又不能破碎，即红细胞膜形成完整的血影细胞，而不是碎裂成碎片悬浮于血红蛋白溶液中。
(三)
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的在于提供一种红细胞破膜方法，它针对上述情况，发明一种操作简便、成本低廉、高效的破膜工艺。
[0005]本发明的技术方案:一种红细胞破膜方法，其特征在于它包括以下步骤:
[0006]1、取适量的人血加入3-6倍体积的生理盐水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800转的条件下离心，15-30分钟。得到含白细胞，血浆蛋白和血小板的上清液并将其挤出，保留下层压积红细胞，重复上述洗涤过程3-5次以，直至上层清液基本无色，以最大限度除去红细胞以外的其他物质，得到洁净压积红细胞。
[0007]2、取一定量的压积红细胞，加入等体积的灭菌高纯去离子水进行5-15分钟的预胀，最后加入2倍体积的水低渗10-20分钟，10000转速下离心30-60分钟，离心后上清液为血红蛋白溶液。
(四)【具体实施方式】:
[0008]以下将通过【具体实施方式】的形式再对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的【具体实施方式】，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0009]实施例1洗血
[0010]取适量的人血加入3-6倍体积的生理盐水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800转的条件下离心，15-30分钟。得到含白细胞，血浆蛋白和血小板的上清液并将其挤出，保留下层压积红细胞，重复上述洗涤过程3-5次以，直至上层清液基本无色，以最大限度除去红细胞以外的其他物质，得到洁净压积红细胞。
[0011]实施例2预胀
[0012]取一定量的压积红细胞，加入等体积的灭菌高纯去离子水进行预胀，预胀时间定为2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30分钟，分别于400倍显微镜下观察不同预胀时间细胞形态，根据细胞的圆润程度确定最佳预胀时间。
[0013]实施例3低渗破膜
[0014]向预胀好的红细胞中加入2倍体积的水低渗破膜，时间定为3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，50分钟，分别于400倍显微镜下观察不同破膜时间细胞形态，根据细胞的破裂程度、纯化血红蛋白的浓度、破膜液过滤的难易程度确定最佳破膜时间。之后再10000转速下离心30-60分钟，离心后上清液为血红蛋白溶液。
【权利要求】
1.一种红细胞破膜方法，其特征在于它包括以下步骤:取适量的人血加入3-6倍体积的生理盐水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800转的条件下离心，15-30分钟；得到含白细胞，血浆蛋白和血小板的上清液并将其挤出，保留下层压积红细胞，重复上述洗涤过程3-5次以，直至上层清液基本无色，以最大限度除去红细胞以外的其他物质，得到洁净压积红细胞；取一定量的压积红细胞，加入等体积的灭菌高纯去离子水进行预胀，最后加入2倍体积的水低渗10-20分钟，10000转速下离心30-60分钟，离心后上清液为血红蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的一种红细胞破膜方法，预胀的时间为5-15分钟。
3.根据权利要求1所述的一种红细胞破膜方法，低渗破膜的时间为10-20分钟。
【文档编号】C12N5/078GK104357388SQ201410696929
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】李凤娟, 赵宝娟, 王程, 胡晓晨, 刘云鹏, 张释元 申请人:天津工业大学