一种abo亚型血型检测卡的制作方法
【专利说明】一种ABO亚型血型检测卡
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及输血医学领域，尤其涉及一种ABO亚型血型检测卡及其制备。
[0003]
【背景技术】
[0004]ABO血型鉴定作为现代输血前检测最关键的步骤之一，其准确的检测结果是确保输血安全的先决条件。在临床上因ABO血型或亚型不合引起的输血反应是最严重的，引发的病死率高。已引起临床医生及输血工作者的高度重视，ABO亚型在血型检测中往往因为正反定型不符而被发现。
[0005]ABO血型抗原的变异体较多，这些变异体是由ABO位点上的稀有基因作用而产生，它们可因红细胞膜上的抗原分布不同而表现出不同的亚型。ABO亚型的血清学共同特点是与抗AJAB反应很弱，甚至无反应，血清中有时含有不规则的抗^或抗B1，如为分泌型，唾液中一般都含有A、B物质和H物质。目前对于ABO亚型的确认采用血清学方法进行区分，在A类表现型亚型可有A1、A2、A3、Ax、Am、AencUAe 1、Ay等，而B亚型的分型一般参照A亚型。
[0006]微柱凝胶免疫检测技术是20世纪90年代产生的一种免疫检测技术，其基本原理是利用分子筛技术，离心技术和特异性免疫反应技术原理，把血型血清学技术与凝胶分子筛技术有机结合起来，可灵敏地检测出可能存在的微弱血型抗原抗体反应，被认为是血型血清学检验的里程碑。
[0007]目前国内外已有一些厂家生产ABO亚型血型检测卡，但是存在以下一些不足:一是采用单一型号的葡聚糖凝胶或聚丙烯葡聚糖凝胶，使得灵敏度与特异性无法兼顾;二是采用生理盐水或抗体缓冲液溶胀凝胶，使得凝胶无法充分完全溶胀，以及破坏反应体系的离子强度;三是对添加不同抗体的凝胶，凝胶洗涤缓冲液完全一致，无法有效保护抗体稳定性；四是将必须的项目分散到几张检测卡中，实验工作量大、结果判断不便。
[0008]
【发明内容】
[0009]本发明就是要克服以上不足，提供一种灵敏度高、特异型好，稳定性强、保质期长的ABO亚型血型检测卡及其制备方法。
[0010]为达到上述目的，本发明通过以下技术方案进行解决，包括以下步骤:
一种ABO亚型血型检测卡，包括含有八个微柱的检测卡，所述五个微柱中分别装有等量的抗A凝胶、抗^凝胶、抗AB凝胶、抗B凝胶、抗H凝胶，其余三个微柱装有等量的空白凝胶;其通过以下方法制备而成:
(I)葡聚糖凝胶的溶胀:选用至少两种交联葡聚糖凝胶进行混合，然后加入纯化水中进行充分悬浮溶胀，再用纯化水洗涤去除破碎颗粒，得到大小均匀、呈完整球形的葡聚糖凝胶颗粒； (2)制备各抗体稀释液:
抗A稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)10-15g/L、牛血清白蛋白20-25g/L、蔗糖15-20g/L，其pH值为6.6-6.8;
抗^稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)10-15g/L、牛血清白蛋白15-18g/L、蔗糖20-22g/L，其pH值为6.6-6.8;
抗AB稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)15-20g/L、牛血清白蛋白10-15g/L、蔗糖18-26g/L，其pH值为6.6-6.8;
抗B稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)15-20g/L、牛血清白蛋白15-20g/L、蔗糖25-30g/L，其pH值为6.6-6.8;
抗H稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)5-10g/L、牛血清白蛋白5-8g/L，其pH值为6.6-6.8;
空白凝胶洗涤缓冲液:以纯化水为溶剂，缓冲液中含有氯化钠I.75g-2.07g/L、磷酸氢二钠0.185-0.2198/1、磷酸二氢钠0.203-0.248/1、甘氨酸18-218/1;并调节 pH值为6.6-6.8；
(3)制备各抗体工作液:
取抗A单克隆抗体浓缩液与抗A稀释液进行混合，使得到的抗A单克隆抗体工作液的效价 M28;
取抗Ai单克隆抗体浓缩液与抗Aj#释液进行混合，使得到的抗A1单克隆抗体工作液的效价2 8;
取抗AB单克隆抗体浓缩液与抗AB稀释液进行混合，使得到的抗AB单克隆抗体工作液的效价2 128;
取抗B单克隆抗体浓缩液与抗B稀释液混合，使得到的抗B单克隆抗体工作液的效价之
128；
取抗財允体与抗H稀释液混合，使得到的抗11抗体工作液的效价2 8 ；
(4)制备凝胶:
取八份等量的葡聚糖凝胶颗粒，取五份葡聚糖凝胶颗粒分别用等量的抗A稀释液、抗A1稀释液、抗AB稀释液、抗B稀释液、抗H稀释液进行洗涤至少三次，再分别加入相对应的抗A单克隆抗体工作液、抗六:单克隆抗体工作液、抗AB单克隆抗体工作液、抗B单克隆抗体工作液、抗H单克隆抗体工作液进行混合，得到抗A凝胶、抗^凝胶、抗AB凝胶、抗D凝胶、抗H凝胶；
另外三份葡聚糖凝胶颗粒分别用等量的空白凝胶洗涤缓冲液进行洗涤至少三次，再分别加入空白凝胶洗涤缓冲液进行混合，得到抗三份空白凝胶；
(5)分装:
按照每管24-32微升的量，将抗A凝胶、抗^凝胶、抗AB凝胶、抗B凝胶、抗H凝胶和三份空白凝胶分别灌注到八个微柱中，形成ABO亚型血型检测卡。
[0011]进一步方案，所述步骤(I)中交联葡聚糖凝胶为交联葡聚糖凝胶G-25、交联葡聚糖凝胶6-50、交联葡聚糖凝胶6-75或交联葡聚糖凝胶6-100。
[0012]进一步方案，所述步骤(I)中在交联葡聚糖凝胶混合物中加入纯化水中进行充分悬浮溶胀，其中交联葡聚糖凝胶混合物和纯化水的质量体积比为1:2-1: 3。
[0013]进一步方案，所述步骤(I)中悬浮溶胀的时间为48-72小时。[OOM]进一步方案，所述步骤(4)中抗A单克隆抗体工作液、抗Ai单克隆抗体工作液、抗AB单克隆抗体工作液、抗B单克隆抗体工作液、抗H单克隆抗体工作液、空白凝胶洗涤缓冲液分别与洗涤后葡聚糖凝胶颗粒按体积比为I: 2-1:3进行混合。
[0015]本发明选择八等份由至少两种交联葡聚糖凝胶用纯化水中进行溶胀所得的葡聚糖凝胶颗粒，再分别用抗A稀释液、抗々:稀释液、抗AB稀释液、抗B稀释液、抗H稀释液和三份空白凝胶洗涤缓冲液分别对其进行洗涤至少三次，再加入相对应的抗A单克隆抗体工作液、抗八:单克隆抗体工作液、抗AB单克隆抗体工作液、抗B单克隆抗体工作液、抗H单克隆抗体工作液和空白凝胶洗涤缓冲液进行混合，得到抗A凝胶、抗々:凝胶、抗AB凝胶、抗D凝胶、抗H凝胶和三份空白凝胶。再将它们依次装入检测卡中的八个微柱中，形成ABO亚型血型检测卡。该检测卡用来检测新生儿的血型鉴定，从而实现对ABO血型或亚型进行诊断、预防和治疗具有重要的临床意义。
[0016]本发明的优点是:
1、本发明采用不同大小、不同筛分范围的交联葡聚糖凝胶进行混合，有效避免了单一交联葡聚糖凝胶的特异性与灵敏度不能兼顾的特点，可实现在保证特异性的同时，仍拥有很高的灵敏度；
2、本发明采用纯化水作为交联葡聚糖凝胶的溶胀溶液，可以使凝胶颗粒完全充分溶胀；
3、本发明用各抗体稀释液洗涤葡聚糖凝胶颗粒，从而不会破坏抗体的保护液成分，能更有效的保证抗体的稳定性;并保证了缓冲液体系的纯粹性，不受其他离子的影响，有效保证了体系的离子强度。
[0017]4、本发明将ABO亚型检测的所有项目集中于一张卡上，实验操作简单，结果观察判断便利，减轻了医护工作人员的工作负担。
[0018]
具体实施办法实施例一:
一种ABO亚型血型检测卡包括含有八个微柱的检测卡，五个微柱中分别装有等量的将抗A凝胶、抗^凝胶、抗AB凝胶、抗B凝胶、抗H凝胶，另三个微柱中均装有等量的空白凝胶;其通过以下方法制备而成:
(1)葡聚糖凝胶的溶胀:
选用交联葡聚糖凝胶G-25、交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-75按照质量比1:2:1进行混合得葡聚糖凝胶混合物，然后按照葡聚糖凝胶混合物和纯化水的质量体积比为1:3加入纯化水，进行悬浮溶胀48小时后;再用纯化水对其洗涤三次，去除破碎颗粒，得到大小均匀、呈完整球形的凝葡聚糖胶颗粒；
(2)抗体稀释液的配制:
抗A稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)10g/L、牛血清白蛋白20g/L、蔗糖20g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8;
抗八!稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)15g/L、牛血清白蛋白16g/L、蔗糖20g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8;
抗AB稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)16g/L、牛血清白蛋白12g/L、蔗糖20g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8;
抗B稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)15g/L、牛血清白蛋白15g/L、蔗糖30g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8;
抗H稀释液:以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA二钾盐)5g/L、牛血清白蛋白5g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8;
空白凝胶洗涤缓冲液:以纯化水为溶剂，缓冲液中含有氯化钠1.75gg/L、磷酸氢二钠
0.185g/L、磷酸二氢钠0.203g/L、甘氨酸18g/L;并调节pH值为6.6-6.8；
(3)抗体稀释:
取抗A单克隆抗体浓缩液，与步骤二中抗A稀释液混合，使得到的抗A单克隆抗体工作液效价2 128;
取抗Ai单克隆抗体浓缩液，与步骤二中抗Ai稀释液混合，使得到的抗Ai单克隆抗体工作液效价2 8;
取抗AB单克隆抗体浓缩液，与步骤二中抗AB稀释液混合，使得到的抗AB单克隆抗体工作液效价2 128;
取抗B单克隆抗体浓缩液，与步骤二中抗B稀释液混合，使得到的抗B单克隆抗体工作液效价2 128;
取抗H单克隆抗体浓缩液，与步骤二中抗H稀释液混合，使得到的抗H单克隆抗体工作液效价2 8;
(4)凝胶洗涤:
将步骤(I)中溶胀的葡聚糖凝胶颗粒均分为八等份，其中一份用等量的