一种IgM血清学检测质控物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫标记分析领域，具体设及一种IgM血清学检测质控物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 传染病检测时需要的阳性和阴性的质控品用于检测试验的过程控制，确保最终结 果输出的正确性和准确性。阴性质控品通常由为正常人的血清，不包含任何需检测的目的 抗体。阳性质控品通常是由从病人体内获得的含有大量需检测的目的抗体的血清或血浆用 阴性质控品进行稀释制备而成。
[0003] 众所周知，IgM抗体会在传染性疾病抗原入侵机体后产生的第一次免疫应答时产 生。IgM抗体仅会在免疫应答早期一个较短的时间段存在，一般会在几周到几个月。IgG抗体 的免疫应答产生和持续的时间都会在相对较长的时间，一般为几年。
[0004] IgM抗体是初次免疫应答产生的，因此，其持续时间是很短暂的，但是IgM抗体的检 测却是非常重要的，在患者早期感染时即可检测出。然而，由于病人感染后产生IgM持续时 间短，很难从个体上获得充足的IgM抗体阳性血用于传染病IgM检测的质控。因此需要使用 动物的特异性IgG抗体作为检测中的阳性质控（此处不太理解，貌似可W删除），就如同 W089/10980所述。W089/10980中记载了采用免疫动物的操作制备IgM抗体的方法，其中需要 长达15天的时间才能够制备得到相应的IgM抗体，并且需要喂养相应的动物体，所需时间和 成本都是极其巨大。
[0005] 本领域常见的如捕获法测定血清中IgM抗体，也可将IgM与动物源性的特异性抗体 进行偶联得到的制备物作为质控的阳性参照。由于该制备物需要将动物源性的特异IgG和 人源非特异IgM的偶联，目前偶联的方法多采用蛋白偶联的经典方法即戊二醒偶联，该方法 采用一种常用的同型双功能交联剂一戊二醒进行偶联，它的两个醒基可与蛋白的氨基形成 Schiff键(-N=C-)，将他们W五碳桥连接起来。但由于其是非特异性双向交联剂，因此存在 交联分子间的比例不严格，大小也不一，特异性偶联率低的缺点。采用戊二醒法进行动物源 性的特异IgG和人源非特异IgM偶联时，除生成动物源性的特异IgG-人源非特异IgM产物 夕h还不可避免的生成动物源性的特异IgG-动物源性的特异IgG和人源非特异IgM-人源 非特异IgM两种杂质产物，且很难分离纯化，严重影响最终使用时的活性。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中采用的偶联方法会使偶联产物产生杂质，并进一步影响偶联产物 的最终使用时的活性的缺陷。本发明提供一种新的偶联技术，本发明提供的新的偶联技术 可用于动物源性的特异IgG和人源非特异IgM的偶联。
[0007] 本偶联技术可W克服戊二醒偶联时交联分子间的比例不严格，大小也不一，特异 性偶联率低的缺点，使动物源性的特异IgG和人源非特异IgM偶联时产物几乎全部为动物源 性的特异IgG-人源非特异IgM,而很少存在动物源性的特异IgG-动物源性的特异IgG和人 源非特异IgM-人源非特异IgM两种杂质，从而提高最终产物的活性。采用本发明所述方法 制备得到的偶联产物可W用于IgM的血清学检测的质量控制，其效果优于戊二醒法标记得 到的偶联产物。
[0008] 本发明采用如下技术方案：
[0009] 本发明公开了一种偶联复合物，该偶联复合物包括偶联载体和与之偶联的至少两 种抗体，所述偶联载体具有2个W上的与所述抗体偶联的偶联位点。
[0010] 在一个【具体实施方式】中，所述抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为动 物源性的特异IgG，所述第二抗体为人源非特异IgM，所述偶联载体为多聚糖。
[0011] 本发明公开了一种IgM血清学检测质控物的制备方法，其特征在于，采用多聚糖作 为载体，将动物源性的特异IgG和人源非特异IgM进行偶联。
[0012] 本发明公开了一种IgM血清学检测质控物的制备方法，其特征在于，所述方法将多 聚糖的径基氧化成醒基后，将动物源性的特异IgG和人源非特异IgM与氧化后的多聚糖进行 偶联。
[0013] 本发明公开的IgM血清学检测质控物的制备方法采用一种多聚糖作为交联载体， 通过采用高舰酸钢-棚氨化钢法进行交联，所述方法包括如下步骤：
[0014] (1)称取多聚糖和高舰酸钢(NaI〇4)，分别用碳酸盐缓冲液溶解备用；
[001引（2)将多聚糖溶液于2-8 °C放在揽拌器上匀速揽拌，再将化104溶液缓慢滴加到多 聚糖溶液中，避光揽拌反应60min;
[0016] (3)将乙二醇用水稀释10倍，将步骤(2)氧化好的多聚糖从冰箱取出，加入稀释好 的乙二醇，室溫避光反应30min;
[0017] (4)吸取步骤(3)活化好的多聚糖溶液加入到装有动物源性的特异IgG和人源非特 异IgM的透析袋中，混合均匀，于抑9.6浓度为0.05M碳酸盐缓冲液中避光透析，2小时后更换 一次缓冲液，反应15-17小时；
[0018] (5)将偶联物吸出至洁净的玻璃容器中，随后向容器中加入棚氨化钢(Na皿4)，混 合均匀，2-8 °C避光反应2小时；
[0019] (6)将步骤(5)得到的反应物浓缩沉淀后，复溶即制备得到偶联产物。
[0020] 其中，将反应物浓缩沉淀的方法可W采用硫酸锭沉淀。
[0021] 其中，所述的硫酸锭沉淀的步骤如下:将步骤(5)得到的反应物于2-8°C放在揽拌 器上匀速揽拌，缓慢滴加等体积抑7.4的饱和硫酸锭，混合均匀后，避光、静置60min，将沉 淀后的反应物混合均匀装入离屯、管，4°C1200化pm/min离屯、lOmin，弃上清，留沉淀。
[0022] 优选的，本发明方法的步骤（1)中的多聚糖为葡聚糖，平均分子量从1000至 2800000的均可使用，最佳的分子量范围为40000至1000000,溶解后浓度范围可W是5- 50mg/ml，最佳浓度为20mg/ml。
[0023] 优选的，本发明所述方法步骤（1)中所用化104的溶解后浓度范围可W是5-50mg/ ml，最佳浓度为25mg/ml。
[0024] 优选的，本发明所述方法步骤(4)中动物源的特异IgG和人源非特异IgM的摩尔比 例范围可W从1:10至10:1，最佳摩尔比例为1:1。
[0025] 优选的，本发明所述方法步骤（5 )中NaHB4的最终浓度范围可W是0.0001至 0.0 lmg/ml，最佳浓度为0.025mg/ml。
[0026] 另外，本发明具体提供了一种利用葡聚糖作为载体将动物源性单克隆抗体小鼠抗 肥V单克隆抗体S-13与非特异性的人IgM进行偶联的方法。
[0027] 另外，采用本发明所述的方法制备得到的偶联产物与常规戊二醒方法制备得到的 偶联物相比具有较高的活性，因此，采用本发明所述方法制备得到的偶联产物也属于本发 明的
【发明内容】
。
[0028] 本发明通过采用大分子量的多聚糖作为载体，用高舰酸钢法氧化多聚糖中的径 基，使其氧化成醒基，一个分子量为40000至1000000的葡聚糖分子理论上可形成245-6125 个活化的醒基，一个分子上的活化醒基远远高于戊二醒分子上的2个活性醒基，添加入动物 源的特异IgG和人源非特异IgM后，几乎不可能形成全部由特异性IgG交联的多聚骨架和全 部由人源非特异IgM交联的多聚碳骨架，因此避免出现类似戊二醒两步法标记时的两种杂 质，从而提局最终广物的使用活性。
【具体实施方式】
[0029] 本发明技术方案可W采用如下操作步骤进行实施。
[0030] (1)首先称取适量葡聚糖和适量的高舰酸钢(化1〇4)，用0.05M的pH=9.6的碳酸盐 缓冲液(CB)溶解多聚糖和化104备用，其中葡聚糖平均分子量从1000至2800000的均可使 用，最佳的分子量范围为40000至1000000,溶解后浓度范围可W是5-50mg/ml，最佳浓度为 20mg/ml，NaI04的溶解后浓度范围可W是5-50mg/ml，最佳浓度为25mg/ml;
[0031] (2)将多聚糖溶液放在揽拌器(2-8°C)上匀速揽拌，再将配好的化104溶液用一毫 升加样枪一滴一滴缓慢加入到多聚糖溶液中，避光揽拌反应60min;
[0032] (3)提前5min将乙二醇用注射用水稀释10倍备用，到时将氧化好的多聚糖从冰箱 取出，并加入稀释好的乙二醇，室溫（16-25°C)避光反应30min;
[0033] (4)吸取适量活化好的多聚糖溶液加入到装有动物源性的特异IgG和人源非特异 IgM的透析袋中，混合均匀，放入抑9.6化的0.05M碳酸盐缓冲液中避光透析，2小时后更换一 次缓冲液，避光透析过夜，反应15-17小时，其中动物源的特异IgG和人源非特异IgM的摩尔 比例范围可W从1:10至10:1，最佳摩尔比例为1:1;
[0034] (5)将偶联物吸出至洁净的玻璃容器中，随后向其中加入适量浓度为的棚氨化钢 (NaHB4)，混合均匀2-8 °C避光反应2小时；其中化册4的最终浓度范围可W是0.0001至 0.0 lmg/ml，最佳浓度为0.025mg/ml。
[0035] (6)将偶联物放在揽拌器(2-8Γ)上匀速揽拌，同时用一毫升加样枪一滴一滴缓 慢加入等体积抑7.4的饱和硫酸锭，混合均匀后，避光、静置60min;
[0036] (7)将沉淀后的标记物混合均匀装入离屯、管，将离屯、机设置至4°C12