专利名称：一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断方法，具体是用连接引物构建融合基因并进行原核表达，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpNl 5-17-47-ELISA。
背景技术：
梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum)感染引起的梅毒(syphilis)是最为重要的人类性传播性疾病(sexual transmission diseases, STD)之一。梅毒潜伏期较长、病情进展相对缓慢、加之病灶中分离梅毒螺旋体的阳性率较低，因而检测梅毒螺旋体特异性抗体的血清学试验成为临床上梅毒病的实验室诊断方法。例如，TRUST(梅毒甲苯胺红不加热血清试验)和TPHA(梅毒螺旋体抗体血凝试验)分别是目前普遍应用于临床的梅毒病初筛和确诊试验。
有文献报道，早期梅毒患者血清中存在梅毒螺旋体TpN30、TpN33和TpN37等抗体， 但在中、晚期梅毒或治疗后患者血清中，此等抗体水平往往明显下降甚至消失；在早、中期梅毒患者血清中，可检测出TpW5、ΤρΝ17, ΤρΝ34和ΤρΝ47等抗体。由于TpW5、TpN17和 TpN47抗体水平较高且稳定、维持时间较长，故被认为是最有临床应用前景的梅毒螺旋体 TpNs抗原。
由于至今尚不能用无生命的人工培养基培养梅毒螺旋体，因而建立基于重组 TpNs (recombinant TpNs, rTpNs)抗原的梅毒血清学检测方法倍受人们重视。目前以单一 rTpNs为抗原所建立血清抗体检测方法已有不少研究报道，但单一重组抗原的灵敏度和特异性较低。为了提高基于rTpNs抗原的梅毒血清学检测方法的敏感性和特异性，我们构建了梅毒螺旋体tpW5、tpN17和tpN47融合基因tpN15_17_47原核表达系统，建立了基于 ! 邛附5-17-47 重组蛋白为包被抗原的 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay ；酶联免疫吸附试验)，为临床梅毒病提供了一种快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。
发明内容
本发明的目的是克服非梅毒抗原试验敏感性和特异性较低，梅毒血清学试验中梅毒抗原试验虽有较高敏感性和特异性，但是需制备大量梅毒抗原导致成本较高的缺点；提供一种廉价、快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。
本发明提供的技术方案是一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤采用基因工程技术构建tpW5、tpW7和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E. C0liBL21DE3pET42a-tpN15-17_47，提纯重组表达产物 rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15_17-47_ELISA。
所述的人工融合基因tpm5-17_47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，具体包含以下步骤 1)梅毒螺旋体tpm5、tpN17和tpN47基因的克隆和测序； 2)人工融合基因tpm5-17_47及其原核表达系统构建和测序； 3)含IPTG的LB培养基中诱导重组蛋白抗原分子rTpN15_17_47表达，SDS-PAGE 和BioRad凝胶图象分析系统确定重组表达产物rTpN15-17-47的表达情况和产量； 4) Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rTpN15_17_47 ； 5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。
所述梅毒螺旋体tpW5、tpN17和tpN47基因的克隆方法分别是 1)取离心沉淀的梅毒病人硬性下疳分泌物，用苯酚-氯仿提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA ；2)以梅毒螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpW5、 tpW7和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点NdeI和 XhoI ；3)PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；4)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接力)取用大肠杆菌DH5ci株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E. coli DH5a悬液；6)在上述感受态Ε. coli DH5 α悬液中加入上述连接产物，加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；8)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行NdeI和BioI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tPm5、tPm7和 tpN47后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17 或 pUC-M-fpN47。
所述人工融合基因tpm5-17_47的制备方法是1)上述含有重组质粒 pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17 或 pUC-M-TtpN47 的 E. coli DH5 α 分别在 LB 培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，分别提取E. coli DH5 α中的重组质粒pUC_M_TtpN15、pUC-M-TtpN17或 pUC_M_xtPN47 ；2)根据柔性肽核苷酸序列，设计分别扩增tpm5、tpN17或tpN47基因片段的引物，其中tpm5、tpm7基因下游引物含柔性肽正链序列，tpm7、tpN47基因上游引物含柔性肽负链序列，tpN15基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶NdeI位点，tpW7基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶BioI位点，然后分别以重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的tpW5、tpN17和tpN47基因片段；3)各PCR产物经电泳分离后，在紫外线下确认分别有 tpN15apN17或tpN47基因扩增片段后，采用PCR产物纯化试剂盒，提纯各目的扩增片段后测定各提取物DNA浓度；4)将提纯的tpN15基因扩增片段和提纯的tpN17基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpm5-17复合模板，然后加入tpW5基因上游引物及tpW7基因下游引物进行PCR扩增；按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpm5-17扩增片段、测定提取物DNA浓度；5) 将提纯的tpm5-17扩增片段与提纯的tpN47基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR 试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpm5-17-47复合模板，然后加入tpW5基因上游引物及tpN47基因下游引物进行PCR扩增，按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpm5-17-47扩增片段；6)采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的 tpN15-17-47片段与重组质粒连接，获得连接产物；6)E. coli DH5 α接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态Ε. coli DH5a悬液；7)在上述感受态E. coli DH5 a 悬液中加入上述连接产物，混勻后加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上分别用X-gal 溶液、IPTG均勻涂布，然后涂布接种上述SOC培养物培养、观察；9)选取SOC培养物上的白色菌落在LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和B10I酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tPm5-17_47后， 测定克隆片段的核苷酸序列；序列正确者即为含人工融合基因tpm5-17-47片段的重组质粒 pUC-M-TtpN15_17-47。
所述人工融合基因tpm5-17_47原核表达系统E. C0liBL21DE3pET42a-tpN15_17-47的制备方法是1)含有重组质粒pUC-M-TtpN15_17_47的大肠杆菌E.coli DH5a在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，提取E. coli DH5a中的重组质粒pUC-M_TtpN15_17_47⑵提取的质粒用限制性核酸内切酶NdeI和BioI酶切，酶切产物经电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpm5-17-47后，采用DNA胶回收试剂盒，切胶回收tPm5-17_47片段；3)原核表达载体PET4M用限制性核酸内切酶NdeI和B10I酶切，酶切产物用电泳分离线性化的 pET42a,采用DNA胶回收试剂盒，回收线性化pET4h片段；4)根据tPm5-17_47与线性化 pET42a片段估计浓度，然后tpm5-17-47与线性化pET4h片段按3 1的比例混合，加入连接酶T4DNA连接，获得连接产物力)取用大肠杆菌BL21(DE3)，接种于LB培养液中培养， 离心收集细菌沉淀，制备成感受态E. coli BL21DE3悬液；6)在上述感受态悬液中加入上述连接产物，再加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物培养；8) 挑取SOC培养物上的菌落在LB培养液中培养4-6h，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和B10I酶切、电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA 片段tpm5-17-47，测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E. col iBL21DE3pET42a-tpN15_17-47。
所述重组表达产物rTpN15-17_47的表达和提纯方法是1)在LB液体培养液中接种E. coliBL21DE3pET42a_tpN15_17_47培养，加入IPTG继续培养；2)上述培养物离心、收集细菌沉淀用超声破碎，采用Ni-NTA亲和层析柱，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物 rTpN15-17-47羧基端SXHis标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rTPm5-17_47。
所述rTpN15-17-47-ELISA的建立包括以下步骤1)用紫外分光光度法测定提纯的重组蛋白的浓度；幻抗原包被用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制蛋白浓度为 50 μ g/ml的重组蛋白溶液，96孔聚苯乙烯反应板每孔包被ΙΟΟμ 1，37°C温育池后4°C过夜；次日以0. 05% Tween20-0. Olmol/L PBS (pH7. 4)洗涤3次后用5% BSA封闭；3)分别以 1 800稀释的250例正常人血清为一抗，HRP标记羊抗人IgGCJackson ImmunoResearch) 为二抗，TMB为显色底物，终止反应后用BioRad酶标仪测定各孔OD450值，了解健康人血清 OD450值范围并计算其OD450均值和SD值； 为了保证融合基因原核重组表达产物中三个蛋白抗原有良好的空间构型，构建融合基因时，在tpm5与tpm7、tpN17与tpN47基因之间用相同的两条柔性肽序列(Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser)连接，构建了 tpN15_17_47 融合基因原核表达载体pET4htpN15_17_47，转化入大肠杆菌E. coli BL21DE3中，建立了重组原核表达系统E. coliBL21DE3pET42『tpN1H"47 ；其表达产物 rTpm5-17-47 分子中同时含有 rTpm5、rTpN17 和 rTpN47 三种重组蛋白抗原，提高了基于rTpNs抗原的梅毒血清检测方法的敏感性，不需要分别重组表达rTpN15、rTpm7和rTpN47，降低了生产成本，同时使制备方法更为简便可靠。
本发明的有益效果是1)本发明通过人工融合基因及其原核表达的三价融合重组蛋白rTpN15-17-47能检测不同期梅毒抗体的ELISA，rTpN17-47-ELISA检测965例临床确诊梅毒患者血清标本的阳性率为99. 5%，仅略高于TPHA(98. 3% ) (P > 0. 05)，但明显高于 TpN15-ELISA (83. 1 % ), rTpN17-ELISA (84. 4 % ), rTpN47-ELISA (82. 1 % )禾口 TRUST(72. 2% ) (P < 0. 01) ο 上述 ELISAs 和 TPHA 对 62 例 SLE、86 例 RA 患者和 250 例健康体检者的血清标本检测结果均为阴性，但TRUST分别有5、7和2例标本检测结果为阳性。 上述研究结果表明，我们成功地构建了 rTpN15-17-47融合基因及其高效原核表达系统，我们建产的rTpN15-17-47-ELISA是一种敏感和特异的梅毒血清筛查或诊断的新方法；2)本发明制备的多价重组蛋白rTpN15-17-47是一种对人体无害的细菌融合蛋白，克服梅毒血清学试验中梅毒抗原试验用兔睾丸中传代和繁殖梅毒螺旋体Mchols株导致成本较高的缺点，而且制备方法安全可靠；幻本发明抗原性强、天然表达量高，其抗体存在于各期梅毒患者血清中的Tpm5、Tpm7和TpN47梅毒螺旋体外膜蛋白融合基因重组蛋白rTpNl5-17-47 为包被抗原建立ELISA检测梅毒病人血清抗体，是以基因工程技术一次性表达和提纯三种抗原融合的蛋白分子，故减少了制备环节而成本较低，有利于推广应用。
具体实施例方式序列表说明 序列1是梅毒螺旋体外膜蛋白tpN15基因核苷酸和氨基酸序列(梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No. NC_000919)比较，所克隆的tpW5基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100% )，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，tpN15基因去除信号肽序列及终止密码TAA)。
序列2是梅毒螺旋体外膜蛋白tpN17基因核苷酸和氨基酸序列(梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No. NC_000919)比较，所克隆的tpW7基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100% )，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，tpN17基因去除信号肽序列及启动密码ATG和终止密码TAA)。
序列3是梅毒螺旋体外膜蛋白tpN47基因核苷酸和氨基酸序列(梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No. NC_000919)比较，所克隆的tpN47基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100% )，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，tpN47基因去除信号肽序列及及启动密码ATG)。
序列4是用于连接各目的基因的柔性肽序列(柔性肽序列为自行设计，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列)。
序列5是梅毒螺旋体外膜蛋白人工融合基因tpm5-17_47核苷酸和氨基酸序列[梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人的硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No. :NC_000919)比较，所克隆的tpW5、tpN17和tpN47基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100% ]，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，下划横线区为柔性肽序列，有方框区为表达载体自行携带、用于Ni-NTA亲和层析提取重组融合抗原 rTpN15-17-47的8XHis标签，*表示终止密码TAA) 以下结合实施例进一步说明 实施例实施例建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47_ELISA是采用基因工程技术，首先分别获得tpW5、tpN17和tpN47基因克隆，然后采用相同的两条柔性肽序列分别连接外膜蛋白tpm5与tpm7基因、tpm7与tpN47基因，构建出同时含外膜蛋白 TpN15, TpN17和TpN47三种梅毒螺旋体外膜蛋白抗原。
本发明采用基因工程技术构建人工融合基因tpN15-17_47及其原核表达系统 E. coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47,提纯的该表达系统的重组表达产物rTpN15_17_47抗原包被， 建立用于检测梅毒血清抗体的rTpNl 5-17-47-ELISA。
基因的选择依据有文献报道，早期梅毒患者血清中存在梅毒螺旋体TpN30、 TpN33和TpN37等抗体，但在中、晚期梅毒或治疗后患者血清中，此等抗体水平往往明显下降甚至消失；在早、中期梅毒患者血清中，可检测出TpW5、TpN17, TpN34和TpN47等抗体。 由于TpW5、TpN17和TpN47抗体水平较高且稳定、维持时间较长，故被认为是最有临床应用前景的梅毒螺旋体TpNs抗原。我们构建了梅毒螺旋体tpW5、tpN17和tpN47融合基因 tpN15-17-47,然后构建了 tpW5、tpN17和tpN47基因和原核表达系统，采用Ni-NTA亲和层析法提纯上述目的重组蛋白。分别以rTpN15、rTpN17和rTpN47和rTpN15_17_47为包被抗及原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpm5-ELISA、rTpN17-ELISA, rTpN47_ELISA和 rTpN15-17-47-ELISA0 上述 ELISAs 与 TRUST 及 TPHA 检测 965 例梅毒病人、62 例 SLE,86 例RA患者和250例健康体检者的血清血清标本，与单个外膜蛋白Tpm5、Tpm7和TpN47原核表达重组蛋白的证明rTpN15-17-47-ELISA是敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。
本发明采用rTpN15-17_47融合蛋白抗原包被的理由是目前以单一 rTpNs为抗原所建立血清抗体检测方法已有不少研究报道，但单一重组抗原的灵敏度和特异性较低。为了提高基于rTpNs抗原的梅毒血清学检测方法的敏感性和特异性，我们构建了梅毒螺旋体 tpN15, tpN17和tpN47融合基因(tPm5-17_47)原核表达系统，可一次性表达和提纯同时含有rTpm5、rTpN17和rTpN47抗原的一个融合蛋白抗原分子rTPm5-17_47，减少了表达和提纯工序并由此降低了成本，同时抗原分子量增大可具有提高抗原性的效果。
本实施例检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47_ELISA构建包含以下的步骤 1)梅毒螺旋体tpN15, tpN17和tpN47基因的克隆和测序；2) tpN15_17_47人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导三价重组蛋白抗原分子 rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4) Ni-NTA 亲和层析法提纯rTpN15-17-47 ；5)rTpN15_17_47作为包被抗原的ELISA的建立。
本实施例中的梅毒螺旋体从梅毒病人硬性下疳分泌物中提取；本实施例中所用的一切实验用材料和试剂及相关设备均可从各自国内外相关产业公司或国外公司国内销售代理公司购得。在微生物学、分子生物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的制备方法并进行试用。
以梅毒病人硬性下疳分泌物中提取基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpW5、 tpN17和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点Nde I和XhoI, PCR 参数94°C 5 分钟；94°C 30 秒、52°C 30 秒、72°C 30 秒(其中扩增 ^)N47 需 90 秒)，30个循环；72°C 10分钟；4) PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线下观察目的 DNA扩增条带力)采用多家公司均可提供的PCR产物纯化试剂盒，根据其操作说明书，先提取目的DNA扩增条带；然后采用多家公司均可提供的T-A克隆试剂盒，根据其操作说明书， 用T4DNA连接酶16°C作用12小时将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC_M_T连接，反应总体积20μ 1 ；6)取用可购自多家分子生物学试剂公司大肠杆菌DH5ci株，大肠杆菌拉丁文名是 Escherichia coli (Ε. coli)，该菌(E. coli DH5 α )接种于 LB 培养液中 37°C培养 24 小时，5000转/分4°C离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4°C离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100 μ 1上述 CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态Ε. coli DH5 α ；7)在上述100 μ 1感受态E. coli DH5 α悬液中加入上述连接产物2 μ 1，轻轻混勻后冰浴30分钟，42°C水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500 μ 1，37°C旋转培养(160-180转/分)培养1小时；8)在含 100 μ g/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上分别用浓度为20mg/ml的X_gal溶液40 μ IUOOmmol/ L IPTG 20 μ 1均勻涂布，37°C干燥30分钟，然后涂布接种上述SOC培养物37°C培养M小时后观察菌落产生情况；9)选取白色菌落在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养液中37°C旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒， 按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和B10I酶切、1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpW5、tpN17和tpN47后，委托上海 ^vetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒 pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17 或 pUC-M-TtpN47。
上述人工融合基因tpm5-17_47-的制备方法是1)上述含有重组质粒 pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17 或 pUC-M-TtpN47 的 E. coli DH5 α 分别在含 100 μ g/ml 氨苄青霉素的LB培养液中37°C旋转培养(160-180转/分)培养4_6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作，分别提取E. coli DH5a中的重组质粒pUC-M_TtpN15、 pUC-M_TtpN17 或 pUC-M_TtpN47 ；2)根据柔性肽(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser) 核苷酸序列，设计分别扩增tpm5、tpm7或tpN47基因片段的引物，其中tpm5、tpm7基因下游引物含柔性肽正链序列，tpN17,tpN47基因上游引物含柔性肽负链序列，tpN15基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶Nde I位点，tpN47基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶HioI位点，各引物委托上海hvetrogen等专业公司合成，然后分别以重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的tpN15、tpN17和tpN47, PCR参数-MV 5分钟；94°C 30秒、52°C 30秒、 720C 30秒(扩增tpN47基因片段延伸时间用90秒)，30个循环；72°C 10分钟；3)各PCR 产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认分别有tpW5、tpN17或tpN47基因扩增片段后，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的PCR产物纯化试剂盒，按说明书操作，提纯各目的扩增片段后用紫外分光广度法测定各提取物DNA浓度；4)将IOOng提纯的 tpN15基因扩增片段和IOOng提纯的tpW7基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应(反应参数94°C 5分钟；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 45秒，10个循环)，利用柔性肽正、负链互补性形成tpm5-17复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpW7因下游引物进行PCR扩增(PCR参数94°C 5分钟；94°C 30秒、52°C 30秒、72°C 60秒，30个循环；72°C 10分钟)，按上述方法进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、紫外线下观察、提纯 tpN15-17扩增片段、测定提取物DNA浓度；5)将IOOng提纯的tPm5_17扩增片段与IOOng 提纯的tpN47基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应(反应参数 940C 5分钟；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 45秒，10个循环)，利用柔性肽正、负链互补性形成 tpN15-17-47复合模板，然后加入tpW5基因上游引物及tpN47基因下游引物进行PCR扩增 (PCR 参数94°C 5 分钟；94°C 30 秒、50°C 30 秒、72°C 120 秒，30 个循环；72°C 15 分钟)，按上述方法进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、紫外线下观察、提纯tpm5-17-47扩增片段； 6)采用多家公司均可提供的T-A克隆试剂盒，根据其操作说明书，用T4DNA连接酶16°C作用12小时将提纯的tpm5-17-47片段与克隆质粒如pUC-M-T连接，反应总体积20 μ 1 ；6) Ε. coli DH5a接种于LB培养液中37°C培养M小时，5000转/分4°C离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4°C离心10 分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态 Ε. coli DH5a ；7)在上述100 μ 1感受态E. coli DH5 α悬液中加入上述连接产物2 μ 1，轻轻混勻后冰浴30分钟，42°C水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500 μ 1，37°C 旋转培养(160-180转/分)培养1小时；8)在含100 μ g/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上分别用浓度为20mg/ml的Χ-gal溶液40 μ lU00mmol/L IPTG 20 μ 1均勻涂布，37°C干燥30 分钟，然后涂布接种上述SOC培养物37°C培养M小时后观察菌落产生情况；9)选取白色菌落在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养液中37°C旋转培养(160-180转/分)培养4_6 小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和BioI酶切、1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpm5-17-47后，委托上海hvetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为含人工融合基因tpm5-17-47片段的重组质粒 pUC-M-TtpN15_17-47。
上述原核表达系统E. coliBL21DE3pET42a_tpN15_17_47的制备方法是1)含有重组质粒 pUC_M_XtpN15-17-47的& coU DH5 Q在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养液中37°C旋转培养
(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作，提取E. coliDH5 α中的重组质粒pUC-M-TtpN15_17-47 ；2)提取的质粒用8_16单位的限制性核酸内切酶NdeI和BioI 37°C酶切12小时，酶切产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离后， 在紫外线下确认有目的DNA片段tpm5-17-47后，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的DNA胶回收试剂盒，按说明书操作，切胶回收tpm5-17-47片段；3)原核表达载体pET4h 购自Novagen公司，用8-16单位的限制性核酸内切酶Nde I和BioI 37°C酶切12小时，酶切产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离线性化的pET4h，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的DNA胶回收试剂盒，按说明书操作，回收线性化pET4h片段；4)根据tPm5-17_47与线性化pET4h片段在琼脂糖凝胶中紫外线照射下的荧光强度估计其浓度，然后tpm5-17-47 与线性化pET4h片段按3 1的比例混合，加入T4DNA连接酶37°C连接12小时，反应总体积20 μ 1 ；5)取用购自Novagen公司的大肠杆菌BL21DE3株(E. coli BL21DE3)，该菌接种于 LB培养液中37°C培养M小时，5000转/分4°C离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的Iml 0. lmol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4°C离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100 μ 1上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态Ε. coli BL21DE3 ；6)在上述100 μ 1感受态E. coli BL21DE3悬液中加入上述连接产物2μ 1，轻轻混勻后冰浴30 分钟，42°C水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500 μ 1，37°C旋转培养(160-180 转/分)培养1小时；7)在含100 μ g/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物，37°C培养M小时；8)挑取菌落在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养液中37°C旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和B10I酶切，1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpm5-17-47后，委托上海hvetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统 E. C0liBL21DE3pET42a-tpN15_17-17。
上述重组表达产物rTpN15-17_47的表达和提纯方法是1)在LB液体培养液中接种 E. COliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，30°C或 37300 转 / 分旋转培养 4 小时，加入 0. 5mol/L 的IPTG，按上述条件继续培养4 6小时；幻上述培养物5000转/分4°C离心15分钟，收集细菌沉淀用超声破碎(电压300V，破碎3秒后间歇3秒，共200次)，采用多家公司均可提供的Ni-NTA亲和层析柱，根据说明书操作，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物 rTpN15-17-47羧基端SXHis标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rTPm5-17_47。 实验结果如下1)E. coli BL21DE3pET42a-tpN15_17-47 能有效表达 rTPm5-17_47，经 SDS-PAGE 及 Bio-Rad凝胶图象分析系统检测，rTpN15-17-47产量可达细菌总蛋白的32. 1% ；2)Ni-NTA 亲和层析后rTpN15-17-47可达到电泳纯。
重组表达产物rTpN15-17-47的鉴定分别以5份TPHA和TRUST确认的梅毒抗体阳性患者血清为一抗(1 100稀释)、HRP标记羊抗人IgGCJackson ImmunoResearch)为二抗(1 3000稀释)，用Wfestern Bolt检测上述目的重组蛋白rTpN15_17_47的免疫反应性。
TpN15-17-47-ELISA的建立及敏感性和特异性的检测1)用紫外分光光度法测定提纯的重组蛋白的浓度；幻抗原包被用PH9. 6,0. 01mol/L碳酸盐缓冲液配制蛋白浓度为 50 μ g/ml的重组蛋白溶液，96孔聚苯乙烯反应板每孔包被100μ 1，37°C温育浊后4°C过夜。次日以0.05% Tween20-0.01mol/L PBS(pH7. 4)洗涤3次后用5% BSA封闭。3)分别以 1 800稀释的250例正常人血清为一抗，HRP标记羊抗人IgGCJackson ImmunoResearch) 为二抗，TMB为显色底物，终止反应后用BioRad酶标仪测定各孔OD450值，了解健康人血清 OD45tl值范围并计算其OD45tl均值和SD值。4)以1 800稀释965例梅毒病人、62例SLE、86 例RA患者和250例健康体检者的血清血清标本并测定OD45tl,若被检标本OD45tl值> 阴性对照OD45tl均值+3SD者为阳性。和36例RA患者血清进行检测。
所述rTpN15-17-47-ELISA方法特异性与灵敏度判定。
不同血清学方法TRUST、TPHA 和 rTpN15_ELISA、rTpN17_ELISA、rTpN47_ELISA、 rTpN15-17-47-ELISA对梅毒、SLE, RA、健康体检者血清标本检测及比较结果见表1和2。
表1对梅毒病人血清标本检测及比较结果
权利要求
1.一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤采用基因工程技术构建tpm5、tpm7和tpN47的人工融合基因tpm5-17-47及其原核表达系统E. coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47,提纯重组表达产物rTpN15-17_47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpm5-17-47-ELISA。
2.根据权利要求1所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法， 其特征在于所述的人工融合基因tpm5-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法， 具体包含以下步骤1)梅毒螺旋体tpW5、tpN17和tpN47基因的克隆和测序；2)人工融合基因tpm5-17-47及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导重组蛋白抗原分子rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和 BioRad凝胶图象分析系统确定重组表达产物rTpN15-17-47的表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rTpN15-17-47 ；5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。
4.根据权利要求3所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法， 其特征在于所述梅毒螺旋体tpW5、tpN17和tpN47基因的克隆方法分别是1)取离心沉淀的梅毒病人硬性下疳分泌物，用苯酚-氯仿提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA ；2)以梅毒螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpW5、tpN17 和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点NdeI和XhoI ；3) PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；4)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接；5)取用大肠杆菌DH5ci株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E. coli DH5a悬液；6)在上述感受态Ε. coli DH5 α悬液中加入上述连接产物， 加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；8)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpW5、tpN17和 tpN47后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17 或 pUC-M-TtpN47。
5.根据权利要求4所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述人工融合基因tpm5-17-47的制备方法是1)上述含有重组质粒 pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17 或 pUC-M-TtpN47 的 E. coli DH5 α 分别在 LB 培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，分别提取E. coli DH5 α中的重组质粒pUC_M_TtpN15、pUC-M-TtpN17或 pUC_M_xtPN47 ；2)根据柔性肽核苷酸序列，设计分别扩增tpm5、tpN17或tpN47基因片段的引物，其中tpm5、tpm7基因下游引物含柔性肽正链序列，tpm7、tpN47基因上游引物含柔性肽负链序列，tpN15基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶NdeI位点，tpW7基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶XhoI位点，然后分别以重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的tpW5、tpN17和tpN47基因片段；3)各PCR产物经电泳分离后，在紫外线下确认分别有tpN15apN17或tpN47基因扩增片段后，采用PCR产物纯化试剂盒，提纯各目的扩增片段后测定各提取物DNA浓度；4)将提纯的tpN15基因扩增片段和提纯的tpN17基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpm5-17复合模板，然后加入tpW5基因上游引物及tpW7基因下游引物进行PCR扩增；按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpm5-17扩增片段、测定提取物DNA浓度；5) 将提纯的tpm5-17扩增片段与提纯的tpN47基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR 试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpm5-17-47复合模板，然后加入tpW5基因上游引物及tpN47基因下游引物进行PCR扩增，按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpm5-17-47扩增片段；6)采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的 tpN15-17-47片段与重组质粒连接，获得连接产物；6)E. coli DH5 α接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态Ε. coli DH5a悬液；7)在上述感受态E. coli DH5 a 悬液中加入上述连接产物，混勻后加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上分别用X-gal 溶液、IPTG均勻涂布，然后涂布接种上述SOC培养物培养、观察；9)选取SOC培养物上的白色菌落在LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tPm5-17_47后， 测定克隆片段的核苷酸序列；序列正确者即为含人工融合基因tpm5-17-47片段的重组质粒 pUC-M-TtpN15_17-47。
6.根据权利要求5所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法， 其特征在于所述人工融合基因tpm5-17-47原核表达系统Ε. coliBL2IDE3pET42a-tpN15-17-47的制备方法是1)含有重组质粒pUC-M-TtpN15_17_47的大肠杆菌E.coli DH5a在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，提取E. coli DH5a中的重组质粒pUC-M_TtpN15_17_47 ;2)提取的质粒用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切产物经电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpm5-17-47后，采用DNA胶回收试剂盒，切胶回收tPm5-17_47片段；3)原核表达载体pET42a用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切产物用电泳分离线性化的 pET42a,采用DNA胶回收试剂盒，回收线性化pET42a片段；4)根据tPm5-17_47与线性化 pET42a片段估计浓度，然后tpm5-17-47与线性化pET42a片段按3 1的比例混合，加入连接酶T4DNA连接，获得连接产物；5)取用大肠杆菌BL21(DE3)，接种于LB培养液中培养， 离心收集细菌沉淀，制备成感受态E. coli BL21DE3悬液；6)在上述感受态悬液中加入上述连接产物，再加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物培养；8) 挑取SOC培养物上的菌落在LB培养液中培养4-6h，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA 片段tpm5-17-47，测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E. col iBL21DE3pET42a-tpN15_17-47。
7.根据权利要求6所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法， 其特征在于所述重组表达产物rTpN15-17-47的表达和提纯方法是1)在LB液体培养液中接种E. coliBL21DE3pET42a_t9N15_17_47培养，加入IPTG继续培养；2)上述培养物离心、收集细菌沉淀用超声破碎，采用Ni-NTA亲和层析柱，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物 rTpN15-17-47羧基端SXHis标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rTpN15-17_47。
8.根据权利要求7所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述rTpN15-17-47-ELISA的建立包括以下步骤1)用紫外分光光度法测定提纯的重组蛋白的浓度；幻抗原包被用PH9. 6,0. Olmol/L碳酸盐缓冲液配制蛋白浓度为 50 μ g/ml的重组蛋白溶液，96孔聚苯乙烯反应板每孔包被100μ 1，37°C温育池后4°C过夜；次日以0. 05% Tween20-0. 01mol/L PBS (pH7. 4)洗涤3次后用5% BSA封闭；3)分别以 1 800稀释的250例正常人血清为一抗，HRP标记羊抗人IgG为二抗，TMB为显色底物，终止反应后用BioRad酶标仪测定各孔OD45tl值，了解健康人血清OD45tl值范围并计算其OD45tl均值和SD值。
全文摘要
本发明涉及一种梅毒血清学筛查或诊断方法。目的是该方法应具有廉价、快速、敏感和特异的特点。本发明提供的技术方案是一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤采用基因工程技术构建tpN15、tpN17和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。所述的人工融合基因tpN15-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
文档编号C12N15/70GK102183646SQ201010605970
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者孙爱华, 严杰 申请人:孙爱华, 严杰