专利名称：一种检测血清中丙肝病毒抗体的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种检测血清中丙肝病毒抗体的方法。
背景技术：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒引起的，较乙型肝炎更为严重的一种传染性疾病，容易转化为肝硬化和肝癌。诊断丙型肝炎的检测方法主要有两种一种是利用PCR扩增法检测丙肝病毒RNA，另外一种是检测丙肝病毒抗体。目前临床多采用酶联免疫方法检测丙肝病毒抗体，首先利用包被在检测板孔内的抗人IgG抗体捕获丙肝病毒抗体，利用细菌、酵母或昆虫细胞株来表达重组抗原，将抗原与 HRP等酶类交联，利用HRP标记后的抗原与丙肝病毒抗体之间产生特异性亲和反应，通过 HRP显色系统来检测和反映抗体水平。但此类方法灵敏度和特异性均不高，同时也仅能应用于丙肝病毒抗体的定性检测，无法反映丙肝病毒抗体随病程的变化情况，不能很好地指导临床的诊疗工作。
发明内容
本发明公开了一种检测血清中丙肝病毒抗体的方法，该方法同时也适用于其他液体如血浆、细胞裂解液中丙肝病毒抗体的检测。为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案来检测血清中丙肝病毒抗体。步骤1.将克隆得到的丙肝病毒基因和报告基因片段亚克隆到带有标签蛋白基因的真核表达载体的多克隆位点处。步骤2.将重组质粒转染入哺乳动物细胞株进行表达，并利用标签蛋白抗体纯化得到报告基因蛋白和抗原的融合蛋白。步骤3.将纯化后的融合蛋白与待测血清常温或37°C孵育1小时，加入protein A/G免疫磁珠常温孵育1小时。步骤4.利用磁力吸附捕获抗原、抗体及protein A/G的复合物，加入报告基因底物进行反应，检测报告基因的激活水平，来反映抗体含量。其中，所述病毒基因可以为全长基因，也可以为部分基因片段或嵌合基因片段，也可以为人工进化得到的优化后的基因片段。上述方案中所述报告基因为不超过3个的荧光素酶或荧光蛋白或β-内酰胺酶基因的串联体，每两个基因之间可以由Gly和kr的短肽隔开。上述方案中所述标签蛋白基因是指包括His、FLAG、V5、Myc, MBP, GST等常用标签蛋白对应的基因片段。上述步骤2中所述转染入哺乳动物细胞株进行融合蛋白表达，可选取瞬时转染表达，也可以通过抗性筛选建立稳定表达株的方法来实现融合蛋白的表达。上述步骤3，4中所述加入protein A/G免疫磁珠捕获抗原抗体复合物的方法仅针对于待测抗体属IgA、IgG类抗体，其他类抗体则需要采取其他方法进行捕获。
上述步骤4中所述加入报告基因底物是针对荧光素酶或β -内酰胺酶而言，对于所选报告基因如为荧光蛋白时，则可以以特定波长的光激发后来检测在发射波长处的荧光信号来定性定量测定荧光蛋白的含量，来反映待测中的抗体水平。上述方案中所述抗体的定量检测是指以已知浓度且呈梯度稀释的抗体做为标准物，来检测报告基因的激活水平，而得到抗体浓度与报告基因激活量之间的剂量效应曲线， 从而来实现抗体浓度或含量的定量检测。本发明提供的丙肝病毒抗体检测方法敏感性和特异性高，具有高通量的特点，同时可实现丙肝病毒抗体的定量检测，还可广泛应用于其他感染性疾病和自身免疫相关疾病的各类抗体检测试剂盒的生产开发与临床诊疗。
图1示含标签蛋白、报告基因、抗原基因的表达质粒的示意图。图2示报告基因激活水平与丙肝病毒抗体间的线性剂量效应。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种血清中丙肝病毒抗体的检测方法。本领域技术人员可借鉴本文内容，适当改进工艺参数加以实现。实施例1.以检测血清中丙肝病毒核心抗体为例，制定以下技术方案。步骤1.重组质粒的构建根据丙肝病毒核心抗原序列(Genbank #AF177036. 1)设计并合成引物对(上游引物:5，AGCACAMT0CTAM0CTC 3，，下游引物:5，AGCGGAGACCGGGGTGG 3，)，以从丙肝患者全血中提取的病毒RNA为模板，扩增出丙肝病毒核心抗原基因(HCV core)并克隆到 T载体进行测序验证。以pGluc-basic (NEB产品)质粒为模板PCR扩增Gaussia Iuciferase (Gluc)基因片段，同时在引物5’末端人工加上FLAG蛋白相对应的核苷酸序列，将扩增得到的 FLAG-GIuc克隆到pcDNA3. 1载体内，同时利用限制性酶切法从T载体上将乙肝病毒核心抗原基因也克隆到pcDNA3. 1载体内，注意保证阅读框的正确。这样，得到FLAG"Gluc-HCV core的重组表达质粒，如图1所示。步骤2.融合蛋白的表达纯化将IOug转染级别的重组质粒用脂质体转染试剂 (Lipofectamine 2000)导入IXlO7真核细胞如HEK293T中，24-48小时后收集细胞并进行裂解，用FLAG抗体亲和层析纯化细胞裂解液中的FLAG-Gluc-HCV core融合蛋白。步骤3.将100 ng纯化后的融合蛋白与50 Ul待测血清室温孵育30 min，加入10 ul protein A/G 免疫磁珠(Pierce biotechnology)室温孵育 30 min，后用缓冲液(50 mM Tris, pH 7. 5, IOOmMNaCl, 5 mM MgCl2，1% Triton X-100)洗 3 次，后用 PBS 缓冲液洗 3次，其间利用磁力吸附捕获抗原抗体复合物。步骤4.向上述复合物中加入50 ul 100 nM Coelenterazine后，利用化学发光仪检测其发光强度。实施例2.抗体与报告基因激活水平间的剂量效应分别用梯度稀释的HCV抗体 (Abeam产品)和Flag抗体按实施例1中的方案来检测报告基因的激活水平，结果如图2所示，提示报告基因激活水平与抗体量之间存在线性剂量效应，以此可以用来进行抗体的定量检测。
权利要求
1.一种检测血清中丙肝病毒(HCV)抗体的方法，包括构建带有标签蛋白基因的丙肝病毒基因和报告基因的重组质粒，将重组质粒导入哺乳动物细胞株进行表达，利用标签蛋白抗体纯化融合蛋白，将融合蛋白与血清孵育，利用免疫磁珠捕获抗原抗体复合物，加入报告基因底物检测报告基因激活水平反映丙肝病毒抗体含量。
2.根据权利要求1的方法，所述标签蛋白为His、FLAG、Myc、V5、MBP等标签蛋白之一。
3.根据权利要求1的方法，所述标签蛋白为FLAG标签蛋白，氨基酸序列如SEQID N0:1 所示。
4.根据权利要求1的方法，所述丙肝病毒基因为编码丙肝病毒结构蛋白或非结构蛋白的基因片段，或上述两种基因的嵌合体，或上述基因经人工进化优化后的基因片段。
5.根据权利要求1的方法，所述丙肝病毒基因为HCVcore，El, E2, NS2, NS3, NS4, NS5 之一。
6.根据权利要求1的方法，所述丙肝病毒基因为HCVcore，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。
7.根据权利要求1的方法，所述报告基因为荧光素酶、荧光蛋白、内酰胺酶之一。
8.根据权利要求1的方法，所述报告基因为荧光素酶GaussiaLuciferase，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
9.根据权利要求1的方法，所述融合蛋白是指丙肝病毒蛋白和报告基因蛋白组成的融合蛋白ο
10.根据权利要求1的方法，所述免疫磁珠是指proteinA或G磁珠。
11.根据权利要求1，7的方法，所述报告基因底物是Coelenterazine。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种检测血清中丙肝病毒(HCV)抗体的方法，包括构建带有标签蛋白基因的丙肝病毒基因和报告基因的重组质粒，将重组质粒导入哺乳动物细胞株进行表达，利用标签蛋白抗体纯化融合蛋白，将融合蛋白与血清孵育，利用免疫磁珠捕获抗原抗体复合物，加入报告基因底物检测报告基因激活水平反映丙肝病毒抗体含量。
文档编号G01N33/68GK102305862SQ20111013651
公开日2012年1月4日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者方辉 申请人:方辉