一种肺癌检测质控品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肺癌检测质控品及其制备方法，尤指一种用于EML4-ALK融合基因 临床常用方法检测的异种瘤组织福尔马林固定石蜡包埋的质控品及其制备方法，属于临床 检验学、病理学和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%，虽然不断有新的治疗药物上市，其预 后仍然很差。随着分子靶向治疗的不断发展，已发现针对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑 制剂(EGFR-TKI)的分子靶向药物能够有效的治疗具有EGFR外显子突变的非吸烟肺腺癌患 者。2007年，日本学者在肺腺癌患者中发现的一个亚群对EGFR-TKI治疗和传统化疗不敏感， 该类亚群存在人类棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)和人类间变性淋巴瘤激酶(ALK)重排 形成的融合基因，即EML4-ALK融合基因，提示其可能对ALK抑制剂敏感。
[0003] EML4-ALK融合基因位于2号染色体短臂上，其5 '端为EML4片段，3 '端为ALK片段，编 码一个由1059个氨基酸组成的蛋白质。目前发现至少14种EML4-ALK的变异体，均为EML4的 人不同外显子与ALK的20外显子相融合。例如:变种1 (vl)，为EML4的13外显子与ALK的20外 显子相连;变种2(v2)，为EML4的20外显子和ALK的20外显子相连;变种3的两个亚种，v3a为 EML4的第6外显子和ALK的20外显子相连，v3b为EML4的第6外显子加上一个33bp的小片段再 和ALK的20外显子相连，等等总共14个变种。
[0004] 目前，对于EML4-ALK融合基因的检测方法主要有三种:RT-PCR、免疫组化（IHC)和 荧光原位杂交方法(FISH)，这三种方法都较常用在EML4-ALK融合基因的临床检测当中。其 中，RT-PCR检测的是RNA水平，IHC方法检测的是EML4-ALK融合基因表达蛋白的水平，而FI SH 方法检测的是革EDNA分子的水平。除了上述方法，Western blot、RACE_coupled PCR以及 iAEP等方法也可用于EML4-ALK检测。随着检测技术的不断进展，很多医院都陆续开展了对 于EML4-ALK融合基因的检测，各个临床实验室检测的方法各不相同，而对于EML4-ALK融合 基因的标准化却鲜少提及。目前尚没有国内外文献报道关于EML4-ALK融合基因检测质量评 价的文章，对于不同实验室检测性能情况的评价以及改善提高其检测的水平都迫在眉睫。
[0005] 临床上对于EML4-ALK融合基因的检测包括FISH、RT-PCR和免疫组化三种常规方 法，其中手工法免疫组化仅作为初筛手段，不能用作诊断，但对于其他方法可进行佐证。然 而对于任意一种方法来说，一个好的质控品是保证检测准确度的关键。传统上的质控品倾 向于使用肺癌患者的组织样本作为检测质控品，但是这种质控品来源局限，一致性较差，在 应用的过程中存在较大的局限性。有机构曾经通过基因编辑方法利用细胞系制备了 EML4-ALK融合基因的样本质控品，这种方法能够获得不同变种的EML4-ALK融合基因，但是制备过 程中缺少组织结构间隙，不能完全类似与组织的情况。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种能用于异种瘤组织EML4-ALK融合基 因临床常用方法检测的质控品。
[0007] 本发明要解决的另一个技术问题是提供异种瘤组织EML4-ALK融合基因临床常用 方法检测质控品的制备方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种肺癌检测质控品，为肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228和肺癌细胞系H1299 分别接种实验动物后生成的肿瘤组织的标本切片。
[0010]所述实验动物为免疫缺陷动物，优选小鼠，最优选Beige SCID小鼠和裸小鼠。
[0011] 所述标本切片采用以下方法制备：
[0012] 1、培养肺癌细胞系；
[0013] 2、建立肿瘤动物模型；
[0014] 3、制备肺癌质控品。
[0015] -种肺癌检测质控品的制备方法，包括以下步骤：
[0016] 1、培养肺癌细胞系；
[0017] 2、建立肿瘤动物模型；
[0018] 3、制备肺癌质控品。
[0019] 本发明选择EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞系H3122 (V1)、H2228 (V3)和阴性肺癌 细胞系H1299,采用异种移植的方法将细胞系在动物体内致瘤后，取产生的异种瘤进行质控 品的制备。这种方法能够制备大量模拟正常组织样本的质控品。
[0020]所述步骤1培养肺癌细胞系是指:肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228、肺癌细胞 系H1299,分别用含10%胎牛血清RPIM-1640培养液培养，培养基中含有10%胎牛血清， 100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素;在37°C含5%⑶2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25% 胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至107-108并处于对数生长期。
[0021 ]所述步骤2建立肿瘤动物模型的步骤为：
[0022] (1)准备若干只Beige SCID小鼠和裸小鼠 ，Beige SCID小鼠用于H2228致瘤，裸小 鼠用于H3122和H1299致瘤；
[0023] (2)细胞消化准备：倒掉旧培养基，向培养瓶中加入lrfBS 2ml，清洗2~3次；加入 2ml胰酶，放入37°C、5 % C02孵箱孵2min;待大部分细胞被消化下来，立即加入4ml培养基终 止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀，待在镜下观察细胞大部分成单个 后转入50ml离心管中，离心，弃去上层培养基，加入2ml roS，吹打混匀，离心，弃去上清液， 加入lml PBS，吹打混匀细胞，形成细胞悬液，转入2ml冻存管中；
[0024] (3)动物接种：将所得1.5ml细胞悬液吹打混匀，分别使用lml注射器吸取0.2ml细 胞悬液，皮下接种到裸小鼠两侧腋下每侧0.2ml，将三只接种的裸小鼠放回SPF隔离器中；每 周观察一次，待瘤长至8至10cm时处死小鼠。
[0025]所述步骤3制备肺癌质控品的步骤为：
[0026] (1)收集肿瘤组织：处死小鼠，分别取出三种肿瘤组织，切成10mm X 10mm X 2mm，用 PBS洗净血污；
[0027] (2)固定：每种肿瘤分别加入30ml 10%中性甲醛固定细胞6-48小时后，加入IX PBS冲洗3次；
[0028] (3)乙醇梯度脱水：加入80 %乙醇15ml，静置30min后，取出；加入90 %乙醇15ml，静 置30min后，取出；加入95 %乙醇15ml，静置20min*2后，取出；加入无水乙醇15ml，静置 20min*2后，取出；
[0029] (4)透明：加入无水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml，静置30min，取出；加入二甲苯 15ml静置30min，取出组织；
[0030] (5)浸蜡:放入56°C蜡盒中浸蜡三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以 上；
[0031] (6)包埋:70°C融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡加入到组织块到包埋盒，再次灌 蜡包埋；
[0032] (7)切片：5um/张切片，切片后于恒温30°C水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于 70°C温箱烤片lh;
[0033] (8)HE染色观察:①样本处理:染色前预热lOmin，二甲苯中脱蜡5分钟；换用新鲜的 二甲苯，再脱蜡5分钟;无水乙醇5分钟;90 %乙醇2分钟;70 %乙醇2分钟;蒸馏水2分钟；
[0034] ②染色:苏木素染色液染色5-10分钟;HCL水溶液分化5s ;浸自来水中反蓝，约5分 钟;蒸馏水再洗涤一遍;95 %乙醇5秒;伊红染色液染色30秒-2分钟；
[0035]③脱水透明封片:95%乙醇脱水2分钟；换用新鲜的95%乙醇再脱水2分钟；二甲苯 透明5分钟;换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；用中性树胶或其它封片剂封片。
[0036] 本发明还对于使用的细胞系通过RT-PCR方法验证EML4-ALK融合基因；对于得到的 切片标本通过雅培公司试剂盒进行FISH检测验证;对于得到的切片标本通过艾德公司试剂 盒进行RT-PCR检测验证;对于得到的切片标本通过免疫组化的方法进行检测验证。
[0037] 本发明选取了两种EML4-ALK融合基因阳性但型别不同的肺癌细胞系和一种EML4-ALK融合基因阴性的肺癌细胞系，将细胞培养达到一定数量，分别制备成细胞悬液接种至免 疫缺陷小鼠体内，待其成瘤并长至一定大小后将瘤取出，并切成l〇mmX 10mmX 2mm，之后将 得到的异种瘤组织通过中性甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作瘤组织蜡 块，对蜡块进行5μπι切片，烤片，制作能用于EML4-ALK融合基因临床检验的质控品。这种通过 细胞系制作的质控品重复性和一致性高，同时能够人为控制和选择所需的EML4-ALK融合基 因型别的质控品，克服了传统质控品的不足。通过利用细胞系接种动物产生的异种瘤制作 的质控品操作简便，试验周期短，能够大批量生产。本研究制作的质控品能够作为肺癌个体 化检测的质控品，用于室内质量控制（IQC)和室间质量评价(EQA)，并且具用较好的重复性 和一致性。
[0038] 本发明的创新点在于:本发明得到的肺癌异种瘤组织质控品可以长期保存在大多 数的温度条件下，在室温和4°C环境保存两周后检测效果无变化。因此，我们得到的切片质 控品可以用于EQA和IQC，在将切片质控品作为EQA评估试验的质控品发放的时候，它可以在 室温下无需冰袋进行邮寄并能长时间保存在_20°C或者_4°C条件下。我们的研究中得到的 肺癌异种瘤组织制作的EML4-ALK融合基因临床检测切片质控品提供了一种可用于制造 IQC 或EQA的质控品的方法。这种利用肺癌异种瘤组织通过福尔马林固定石蜡包埋制作质控品 的方法尚属首例。这种方法也能用于制造一系列的用于个体化检测的福尔马林固定石蜡包 埋的肿瘤标本质控品，例如PIK3CA突变检测和BRAF检测等。
[0039] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内 容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照