手足口病病毒等温扩增检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，旨在提供一种操作简便、灵敏快捷的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒；其技术要点包括：1）等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成；其中：正向引物的碱基序列为ACACAGGTGAGCAGTCATCG；反向引物的碱基序列为AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；分子信标的碱基序列为CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG，3）可用于荧光定量PCR仪的实时检测和手持式荧光检测仪的终点检测。
【专利说明】手足口病病毒等温扩增检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种测试手足口病的剂盒，具体地说，是一种检测手足口病病毒EV71的等温扩增试剂盒。
【背景技术】
[0002]肠道病毒71型(英文名为:Human enterovirus71),简称EV71,是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一,EV71以其高致病性、高死亡率夺去了很多人的生命，根据中国疾病预防控制中心公布的统计数据表明，自2009年以来，手足口病发病率和死亡率呈逐年上升趋势，并连续3年成为我国丙类传染病发病率和死亡率最高的疾病。诊断、治疗和预防是应对和处置重要传染病的三个关键环节，而早期诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据，因此开发针对EV71病毒的快速诊断试剂盒就显得尤为迫切和重要。
[0003]现有的快速检测技术主要有两类:第一类为免疫学方法，包括酶联免疫吸附法、免疫荧光法、同位素标记抗体法、乳胶凝集法、免疫传感器法、免疫扩散法及免疫色谱法等；第二类是以核酸为基础的分子生物学方法，主要有核酸探针法和聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction, PCR)。其中的PCR方法是核酸扩增技术的典型代表,该技术是由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullin等人于1985年发明的，在过去的二十年里，PCR技术作为分子生物学的核心得到了迅猛的发展和应用，特别是在疾病的临床诊断中，PCR技术以其快速、灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的诊断方法，而且使以往无法完成的诊断成为了可能。
[0004]尽管PCR技术长期以来占据着核酸扩增垄断技术的地位，新近研发的一系列等温核酸扩增检测技术正逐渐成为PCR技术的替代技术而被广泛应用。与PCR技术相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程均在同一温度下进行，使它们对仪器的要求大大简化，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备完成反应。目前常用的等`温技术有以下几类:
[0005]1、依赖核酸序列扩增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)
[0006]2、自主序列复制(Self-sustained Sequence Replication, 3SR)
[0007]3、转录介导扩增(Transcription mediated amplification, TMA)
[0008]4、单引物等温扩增技术(Single Primer Isothermal Amplification, SPIA)
[0009]5、滚环扩增技术(rolling circle amplification, RCA)
[0010]6、环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)
[0011]7、链替代扩增技术(Strand displacement amplification, SDA)
[0012]这些核酸扩增技术(PCR技术、等温扩增技术等)的扩增产物为DNA或RNA，与之相对应的扩增产物检测方法主要有以下几种:
[0013]电泳分析:常规变性凝胶电泳后用EB或SYBR Green I染色，在1%_1.5%琼脂糖凝胶中可以轻易识别。目前该方法已很少使用；
[0014]杂交技术:产物通过与特异性探针标记的序列杂交，如32P标记的寡核苷酸序列与扩增产物进行Northern杂交以检测扩增产物；
[0015]酶联凝胶(enzyme-1 inked gel assay,ELGA)技术:用非放射性的辣根过氧化物酶(HRP)标记的探针检测扩增产物。未杂交的探针通过在垂直凝胶电泳中得以分离，然后将凝胶置于有HRP底物的溶液中孵育，则可目测反应结果；
[0016]电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)技术:5’端标记有生物素的捕获探针将扩增产物固定在链霉亲和素结合的磁珠上，下游引物的5’末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。扩增产物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECL)反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应，由此可以对扩增产物进行检测和定量；
[0017]分子信标技术:分子信标是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)现象设计的。分子信标为一莖环结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列长度一般为15~30个碱基，能与目标序列互补，靠近两端的部分序列构成分子信标的茎干区，大约有6-8个碱基对，两端分别标记荧光基团(fIuorophore)和淬灭基团(quencher)。没有目标序列存在时,分子信标保持莖环结构,突光基团与淬灭基团靠近，此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当目标序列存在时，分子信标与序列完全互补的靶序列结合形成双链杂交体时，信标茎干互补区被拉开，荧光基团和猝灭基团距离增大，荧光产生。在核酸扩增体系中应用分子信标可随着扩增的进行，均一地产生荧光信号，使分子信标的环状序列不断与扩增子杂交产生荧光信号进行实时检测。分子信标中常用4- (4’ - 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为淬灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、突光素(Fluoresein)等作为突光基团。
[0018]其中，基于T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、分子信标及RNA酶H的NASBA等温扩增技术因其灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时测定而得到了一定的运用。但是目前的NASBA等温扩增结果检测需要在价格昂贵的荧光定量PCR仪上进行，目前我国装备有大型荧光定量PCR仪的实验室及医院有限，不能满足口岸、基层和偏远地区对于EV71病毒检测的需求。
【发明内容】
[0019]针对上述问题，本发明的目的在于提供一种操作简便、价格低廉的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒。
[0020]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的:一种足口病病毒等温扩增检测试剂盒，包括:1)等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒； 所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成；
[0021]其中:
[0022]所述的正向引物的碱基序列为SEQ ID N0.1:
[0023]ACACAGGTGAGCAGTCATCG ；
[0024]所述的反向引物的碱基序列为SEQ ID N0.2:
[0025]AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT ；[0026]所述的分子信标的碱基序列为SEQ ID N0.3:
[0027]CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG。
[0028]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的等温扩增缓冲液包括TrisHC140mM、KC170mM，MgCl212mM, DTTlOmM, dNTPlmM, rNTP2mM,山梨糖醇 375mM。
[0029]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒,所述的反应酶由T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNA酶H组成。
[0030]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的阳性质控标准品为重组质粒pET_32a0
[0031]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的阳性质控标准品的浓度为IO5Copies/ 反应~IO2Copies/ 反应。
[0032]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。
[0033]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的分子信标荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQl。
[0034]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的分子信标使用浓度为ΙΟΟηΜ。
[0035]上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的等温扩增反应的条件为:650C 5min、42°C 5min预处理，加入酶液42V反应90分钟。
[0036]更优的，上述的手足口病病毒等温扩增`检测试剂盒，所述的阳性质控标准品的构建方法是采用PCR方法对EV71cDNA模板进行扩增，得到所需的EV71VP1基因序列，序列片段经双酶切后与相应双酶切pET-32a质粒载体进行连接，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，并进行双酶切验证以获得所需的阳性质控样品。
[0037]与现有现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点:
[0038]1、本发明提供的技术方案通过设计发夹结构与目标序列部分互补的分子信标，提高检测结果信噪比，在满足实时荧光检测的同时，通过结合手持式荧光检测仪，实现了对于NASBA扩增结果的终点检测，检测灵敏度达到了荧光定量PCR水平，能广泛运用于口岸、基层和偏远地区这些缺乏大型荧光定量PCR仪而人群密度又较大的场所；
[0039]2、针对EV71病毒特异性序列设计引物、分子信标，与传统培养法相比具有更高的特异性、灵敏度高、操作简便、价格低廉；
[0040]3、闭管检测不需后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；
[0041]4、本发明提供的手足口病病毒EV71等温扩增检测试剂盒可作为EV71病毒检测的试剂，用于科研及临床应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1构建的阳性质控样品的电泳检测结果；
[0043]图2EV71等温扩增检测试剂盒实时检测结果；
[0044]图3EV71等温扩增检测试剂盒终点检测结果；
[0045]图4EV71等温扩增检测试剂盒稳定性评价结果。【具体实施方式】
[0046]本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New YorkiColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。本发明给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但保护范围不限于下述的实施例。
[0047]1、根据待检目标的序列特征，设计相应检测引物序列。
[0048]所述的待检目标的序列特征，具体为:待检序列的GC含量、序列保守性及序列二级结构等特征。
[0049]所述的引物序列特征，具体为:针对目标序列设计的两条核酸序列，具有物种特异性及高的扩增效率，其中一条含T7RNA聚合酶启动序列。
[0050]2、根据待检目标的序列特征，设计相应分子信标的环状区序列。
[0051]所述的待检目标的序列特征，具体为:待检序列的GC含量、序列保守性及序列二级结构等特征；
[0052]所述的设计相应分子信标的环状区序列，具体为:选择待检序列中GC含量在20%和80%之间、序列保守性高同时具有最小二级结构的片段作为分子信标的环状区序列，序列长度在10~45碱基之间；
[0053]3、设计合适的分子信标茎干区，并选择相应的标记基团。
[0054]所述的设计合适的分子信标茎干区，具体为:所设计的分子信标茎干区序列为互相完全配对的两段核酸序列，茎`干区序列部分序列与环状区序列一起作为目标杂交区域，其Tm值应该比体系反应温度高5°C以上，且不与环状区序列形成复杂的二级结构，分子信标茎干区序列长度为5~10个碱基对。
[0055]所述的选择相应的标记基团，具体为:分子信标的信号产生机制可以分为荧光共振能量转移、波长红移、金属淬灭、接触淬灭、酶促反应及电化学反应等。每种分子信标可根据需要偶联多个荧光基团或淬灭基团，另外还有生物素、辣根过氧化物酶、地高辛、抗原、半抗原、抗体、量子点、二茂铁及纳米金颗粒等标记的分子信标。本领域的技术人员可以根据具体的检测需要选择合适的标记。
[0056]4、构建阳性质控样品
[0057]所述的阳性质控样品，具体为包含有EV71VP1基因序列的pET_32a质粒。采用PCR技术对EV71cDNA模板进行扩增，得到所需的EV71VP1基因序列(如SEQ ID N0.4所示)，序列片段经双酶切后与相应双酶切pET-32a质粒载体进行连接，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，并进行双酶切验证以获得所需的阳性质控样品(结果如附图1所示)。
[0058]5、选择合适的锁核酸分子信标浓度、引物浓度、二硫苏糖醇(DTT)浓度、K+和Mg2+离子浓度用于等温扩增。
[0059]所述的合适的分子信标使用浓度，具体为:根据等温扩增体系的需要，通过梯度稀释的锁核酸分子信标(50nM - 500nM)，选择合适的分子信标浓度，以获得最佳的信噪比。
[0060]所述的合适的引物使用浓度，具体为:根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的引物(50nM - 500nM),以获得最佳的信噪比。
[0061]所述的合适的DTT使用浓度，具体为:根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的DTT (ImM -1OmM),以获得最佳的信噪比。[0062]所述的合适的K+使用浓度，具体为:根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的K+ (IOmM-1OOmM),以获得最佳的信噪比。
[0063]所述的合适的Mg2+使用浓度，具体为:根据等温扩增体系的需要，通过添加不同浓度的Mg2+ (5mM - 25mM),以获得最佳的信噪比。
[0064]在本发明所述的技术方案中:可以通过荧光识别仪、质谱、凝胶电泳、分子夹、序列分析、DNA/RNA传感器、检验层析试纸条、微阵列系统或变色反应等方式检测分子信标产生的信号，其检测方式可以是实时检测也可以是终点检测。
[0065]实施例1:EV71等温扩增检测试剂盒及其使用
[0066]1、制备包括下列组成成分的试剂盒:等温扩增反应液I管，引物探针混合液I管，T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNA酶H混合液I管，阳性质控样品I管。
[0067]2、样本采集:EV71样本采集遵循一般病原体采集程序，采集如下标本:肛拭子、咽拭子、疱疹液、血清。标本应置于无菌病毒采样液。
[0068]存放:保存在4°C (不能超过4天)或者_70°C或_70°C以下。
[0069]3、样品处理及RNA提取:等温扩增效能依赖于样品RNA的质与量。用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒提取EV71病毒RNA用于检测或保存于_20°C (_70°C更佳)以待检测。
[0070]4、等温扩增及检测
[0071]4.1试剂准备:
[0072]将试剂盒中的等温扩增反应液、`引物探针混合液、阳性质控样品及RNase FreedH20进行解冻。按标本的数量(η)个加上阳性对照(I个)、阴性对照(I个)和空白对照(I个，RNase Free dH20)的数量进行等温反应液的配制，共(n+4)个，配制方法如下:
[0073]
试剂试剂I试剂II
单人份用量8.6ul
配制量(n+4) X8.6ul (n+4) X4ul
[0074]混合好上述反应液后，以每管12.6ul分装于(n+3)个PCR反应管中。
[0075]4.2 加样
[0076]分装好的反应管分别加入已提取好的标本、阴阳性对照品及RNase Free dH20各
3.4ul，然后各加入I滴矿物油(约15ul)
[0077]4.3预处理
[0078]将加好样的PCR管进行65°C 5min、42°C 5min预处理，处理完后各加入4ul酶混液或 4ulRNase Free dH20 (空白对照)。
[0079]4.4等温扩增
[0080]将反应管放置在荧光定量PCR仪或恒温仪上，42°C温浴90分钟，进行实时检测或反应结束后用手持式荧光检测仪进行终点检测。
[0081]上述EV71病毒实时或终点检测的等温扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
[0082]1、采用常规方法提取待测样品RNA为模板，[0083]2、采用EV71等温扩增检测试剂盒进行等温扩增，
[0084]3、将扩增体系置于荧光定量PCR仪进行实时检测或用手持式荧光检测仪进行终
点检测。
[0085]所述的实时检测具体为:选择荧光检测模式为FAM荧光，设定阈值线，若待测样品
荧光增长曲线超过阈值线，并呈对数增长，则判断为阳性，即样品中存在EV71病毒，否则样
品中不存在EV71病毒；
[0086]所述的终点检测具体为:采用手持式荧光检测仪测定等温扩增样品，根据待测样
品荧光信号强度与阴性样品荧光信号强度的比值(信噪比)，判定检测结果:阴性对照与空
白对照的荧光信号强度比值〈1.5，阳性对照与阴性对照的荧光信号强度比值≥2 ；
[0087]所述的等温扩增反应的参数为:65。0 5min>42°C 5min预处理,加入酶液42?反应
90分钟。
[0088]实施例2:EV71等温扩增检测试剂盒实时检测
[0089]实施例中所述研究对象及检测引物与分子信标如实施例1所述。
[0090]经过优化，选择等温检测的反应温度为42°C，确定的反应体系如下:
[0091]
【权利要求】
1.一种手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，包括:1)等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；其特征在于，所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成； 其中: 所述的正向引物的碱基序列为SEQ ID N0.1:
ACACAGGTGAGCAGTCATCG ； 所述的反向引物的碱基序列为SEQ ID N0.2:
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT ； 所述的分子信标的碱基序列为SEQ ID N0.3:
CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGGo
2.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的等温扩增缓冲液包括 Tris HC140mM,KC170mM,MgCl212mM, DTTlOmM, dNTPlmM, rNTP2mM,山梨糖醇 375mM。
3.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的反应酶由T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNA酶H组成。
4.根据权利要 求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控标准品为重组质粒pET-32a。
5.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控标准品的浓度为IO5Copies/反应~IO2Copies/反应。
6.根据权利要求3所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。
7.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的分子信标荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQl。
8.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的分子信标使用浓度为ΙΟΟηΜ。
9.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的等温扩增反应的条件为:65°C 5min、42°C 5min预处理，加入酶液42°C反应90分钟。
10.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控标准品的构建方法是采用PCR方法对EV71CDNA模板进行扩增，得到所需的EV71VP1基因序列，序列片段经双酶切后与相应双酶切pET-32a质粒载体进行连接，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，并进行双酶切验证以获得所需的阳性质控样品。
【文档编号】C12R1/93GK103757130SQ201310633713
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】彭涛, 龙飞, 苏文瀚, 肖静, 殷仙丽, 卢然如 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院, 佛山市烨泰科技有限公司