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【附图说明】
[0040] 图1为三种肿瘤组织制作切片的细胞分布示例情况，其中A1为H3122肿瘤组织切片 10倍物镜下观察结果，B1为H3122肿瘤组织切片100倍物镜下观察结果;A2为H2228肿瘤组织 切片10倍物镜下观察结果，B2为H2228肿瘤组织切片100倍物镜下观察结果;A3为H1299肿瘤 组织切片10倍物镜下观察结果，B3为H1299肿瘤组织切片100倍物镜下观察结果。
[0041] 图2为雅培公司试剂盒检测三种肿瘤组织切片标本的荧光示意图，其中A为100倍 物镜下H1299肿瘤组织切片检测的FISH荧光图，B为100倍物镜下H2228肿瘤组织切片检测的 FISH荧光图，C为100倍物镜下H3122肿瘤组织切片检测的FISH荧光图。
[0042]图3为三种肿瘤组织切片EML4-ALK目的基因和管家基因同时进行实时荧光定量 PCR的曲线图，其中浅绿色线为H1299管家基因曲线，棕色线为G2228 EML4-ALK1检测孔检测 曲线，蓝色线为H3122管家基因曲线，红色线为H3122 EML4-ALK1检测孔检测曲线，橙色线为 H2228管豕基因检测曲线。基线为绿色标记线。
[0043]图4为免疫组化检测三种肿瘤组织切片标本的结果图，其中A为阴性对照免疫组化 结果图，B为H1299肿瘤组织切片免疫组化结果图，C为H2228肿瘤组织切片免疫组化结果图， D为H3122肿瘤组织切片免疫组化结果图。
【具体实施方式】
[0044] 以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：
[0045] 肺癌细胞H1299，北京协和医科大学细胞库，中国 [0046]肺癌细胞H3122，南京科佰生物科技公司，中国
[0047]肺癌细胞H2228,厦门艾德生物医药科技有限公司，中国 [0048] QIAamp DNA Mini Kit，凯杰企业管理有限公司，中国
[0049] 20 X TaqMan Gene Expression Assay，ABI，美国
[0050] 2 X TaqMan Gene Expression Master Mix，ABI，美国
[0051] 中性甲醛、无水乙醇、二甲苯，国药集团化学试剂北京有限公司，中国 [0052]苏木素伊红染色试剂，碧云天生物技术研究所，中国
[0053]上海雅培生物科技有限公司EML4-ALK融合基因检测试剂盒，上海雅培生物科技有 限公司，中国
[0054]厦门艾德生物医药科技有限公司EML4-ALK融合基因检测试剂盒，厦门艾德生物医 药科技有限公司，中国
[0055]免疫组化相关试剂盒及试剂，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国 [0056]实施例1:异种瘤组织EML4-ALK融合基因临床检测质控品制备 [0057] 一 ·方法 [0058] 1.肺癌细胞系的培养
[0059] 肺癌细胞H3122、H2228、H1299用含10%胎牛血清RP頂-1640培养液培养，培养基中 含有10%胎牛血清，100iu/ml青霉素和100IU/ml链霉素。在37°C含5%⑶2的恒温细胞培养 箱中培养，用〇. 25 %胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至所需数量107- 1〇8并处于对数生长期。
[0060] 2.通过PCR方法验证细胞系EML4-ALK基因融合情况
[0061 ] (l)RNA提取:①倒掉Η1299、Η2228和Η3122旧培养基，PBS清洗两次，直接在培养瓶 中加入2.5ml裂解液ΜΖ裂解细胞，用取样器吹打几次。
[0062]②将样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
[0063] ③4°C，12000rpm，离心5min，转移500ul到新的无 RNase的离心管中。
[0064]④加入200ul氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置5min。
[0065]⑤4°C，12000离心15min，样品会分成3层，黄色的有机相，中间层和无色的有机相， RNA主要在水相中，水相的体积约为裂解液体积的50%，把水相转移到新管中。
[0066]⑥量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1.5倍的无水乙醇，混匀。将得到的溶 液和沉淀一起转移到miRspin column中，室温12,000rpm离心30s，若以此不能将全部液体 和混合物加入column，可分两次，离心后弃掉流出液，保留miRspin column。
[0067] ⑦向miRspin column中加入500ul去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12，OOOrpm离 心30s，弃废液。向miRspin column中加入700ul漂洗液RW，室温静置2min，室温12，OOOrpm离 心30s，弃废液。
[0068] ⑧向miRspin column中加入700ul漂洗液RW，室温静置2min，室温12，000rpm离心 30s，弃废液。
[0069] ⑨将miRspin column放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心lmin，去除残余液体。 [0070]⑩离心后将miRspin column与室温放置片刻，以充分晾干，放置残余的酒精对后 续的RT等步骤造成影响。
[0071] @将111丨1^口;[11 column置于新的1 · 5ml离心管中，加入40ul无 RNA酶的水，室温放置 2111；[11，室温12,000离心2111；[11。
[0072] (2)逆转录 PCR(RT-PCR)反应：
[0073] ①将试剂盒试剂和样品混匀离心，置于冰上。
[0074] ②配制如下体系：样本RNA 5ul，引物1.7ul，水5.3ul;总计12ul。
[0075] 混匀上述体系并稍微离心。
[0076] ③向上述体系中继续加入试剂成为最终体系：
[0077] 5 X 反应缓冲液4ul，RiboLock? RNA酶抑制剂lul，10mM dNTP Mix 2ul， RevertAidTM M-MuLV逆转录酶lul;总计20ul。混勾体系，短暂离心。
[0078]④设置反转录程序进行反转录操作:温育42°C 60min;热反应72°C 5min。
[0079]⑤通过分光光度法检测cDNA浓度并将样品保存在_70°C。
[0080] (3)PCR反应检测细胞系EML4-ALK融合基因：
[0081 ] ①离心cDNA样本、引物、Mix和RNase-free water并置于冰上。
[0082]②配制反应体系：
[0083] 表 1
[0084]
[0085] ③将上述混合体系混匀，并离心。
[0086] ④加入样本每种2. lul到每份混合体系的PCR管，最后一管作为空白孔不加入样本 RNA〇
[0087] ⑤设置熔解曲线程序：
[0088] 表 2
[0089]
[0090] ⑥将PCR管放入PCR仪，启动PCR程序。
[0091]⑦将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳、成像，同时对扩增产物进行测序分析。 [0092] 3.小鼠动物模型的建立
[0093] ①准备若干只Beige SCID小鼠和裸小鼠 ，Beige SCID小鼠用于H2228致瘤，裸小鼠 用于H3122和H1299致瘤。三种肺癌细胞用含10%胎牛血清RP頂-1640培养液培养，培养基中 含有10%胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。在37°C含5%⑶2的恒温细胞培养 箱中培养，用胰蛋白酶消化进行细胞传代，扩大培养至所需数量1〇 7~1〇8并处于对数生长 期。
[0094]②细胞消化准备：倒掉旧培养基，向培养瓶中加入lxPBS 2ml，清洗2~3次；加入 2ml胰酶，放入37°C、5 % C02孵箱孵2min;待大部分细胞被消化下来，立即加入4ml培养基终 止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀，待在镜下观察细胞大部分成单个 后转入50ml离心管中，离心，弃去上层培养基，加入2ml roS，吹打混匀，离心，弃去上清液， 加入lml PBS，吹打混匀细胞，形成细胞悬液，转入2ml冻存管中。
[0095]③动物接种:将所得1.5ml细胞悬液吹打混匀，分别使用lml注射器吸取0.2ml细胞 悬液，皮下接种到裸小鼠两侧腋下每侧〇.2ml，将三只接种的裸小鼠放回SPF隔离器中。每周 观察一次，待瘤长至8至10cm时处死小鼠取瘤。
[0096] 4.切片质控品的制备
[0097] (1)收集肿瘤组织：颈椎脱臼法处死小鼠，分别取出三种肿瘤组织，切成10mmX 10臟X 2臟，用PBS洗净血污；
[0098] (2)固定:每种肿瘤分别加入30ml 10%中性甲醛固定细胞6-48小时后，加入1XPBS 冲洗3次；
[0099] (3)乙醇梯度脱水：加入80 %乙醇15ml，静置30min后，取出；加入90 %乙醇15ml，静 置30min后，取出；加入95 %乙醇15ml，静置20min*2后，取出；加入无水乙醇15ml，静置 20min*2后，取出；
[0100] (4)透明：加入无水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml，静置30min，取出；加入二甲苯 15ml静置30min，取出组织；
[0101] (5)浸蜡:放入56°C蜡盒中浸蜡三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以 上；
[0102] (6)包埋：70°C融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡加入到组织块到包埋盒（约 5〇〇ul)，再次灌蜡包埋；
[0103] (7)切片：5um/张切片，切片后于恒温30°C水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于 70°C温箱烤片lh;
[0104] (8)HE染色观察:①样本处理:染色前预热lOmin，二甲苯中脱蜡5分钟;换用新鲜的 二甲苯，再脱蜡5分钟;无水乙醇5分钟;90 %乙醇2分钟;70 %乙醇2分钟;蒸馏水2分钟；
[0105] ②染色:苏木素染色液染色5-10分钟;HCL水溶液分化5s ;浸自来水中反蓝，约5分 钟;蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟）；95 %乙醇5秒;伊红染色液染色30秒-2分钟；
[0106] ③脱水透明封