用于区别牙鲆中的性别的snp标志物的制作方法
【专利说明】用于区别牙鲆中的性别的SNP标志物
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2014年9月18日提交的韩国专利申请No. 10-2014-0124525的优先 权及自其得到的所有权益，其内容通过提及完整并入。
[0003] 发明背景
[0004] 本公开内容涉及用于性别区别的标志物，并且更具体地涉及用于牙鲆（Olive flounder)中的性别区别的标志物。
[0005] 由于雌性牙鲜（Paralichthys olivaceus)比雄性牙鲜更快生长并且具有更高的 经济价值，雌性牙鲆相对于雄性牙鲆是更优选的。一般地，培养的牙鲆中的雄性和雌性牙鲆 之间的性别比率几乎是1:1，用雌性鲽替换雄性牙鲆会能使得降低培养的牙鲆的生产成本， 并且如此大大提高其生产力（productivity)。然而，生产牙鲜的雌性种子（female seed) 的常规技术是非常困难且复杂的，而且测定鱼中的性别的机制也随物种而极大变化。牙鲆 先天赋予遗传性别决定系统（其在出生时决定性别）和环境性别决定系统（其可以在通过 高水温或低水温辅助的性别分化期期间将雌性牙鲆的性别转化成雄性牙鲆）两者。因此， 若将假雄性（pseudomale)(其在出生时是雌性，但是通过于高水温或低水温培养而转化成 雄性）与雌性育种，则可以产生遗传雌性鱼种子，如此在种子生产时提高雌性的百分比。
[0006] 韩国专利公开文本No. 2012-0027843披露了用于牙鲆中的性别测定的方法，其能 够经由使用用于牙鲆中的性别测定的引物组比较芳香酶基因表达量进行早期测定。
[0007] 发明概述
[0008] 然而，上文叙述的技术是用于测定性别分化后的性别的方法，并且尚未开发出可 以测定性别分化前的性别的方法。
[0009] 本公开内容是为了解决各种限制，包括上文描述的限制，以及为了提供能够测定 性别分化前的牙鲆种子性别的标志物。然而，上述主题仅为了例示目的，并且本公开内容的 范围不限于此。
[0010] 根据一个例示性的实施方案，提供了用于测定牙鲆中的性别的DNA多核苷酸或与 其互补的多核苷酸，其选自下组：i)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO: 1的核酸序列的多核 苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID NO: 1的第523个碱基是C或T ;ii)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO:2的核酸序列的多核 苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:2的第150个碱基是A或T ;iii)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:3的核酸序列的多核 苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID NO: 3的第252个碱基是A或C;iv)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO:4的核酸序列的多核 苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:4的第329个碱基是T或G;v)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:5的核酸序列的多核 苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID NO: 5的第108个碱基是C或G ;vi)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO:6的核酸序列的多核 苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:6的第150个碱基是A或T;vii)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:7的核酸序列的多 核苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID NO:7的第322个碱基是C或G;viii)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO:8的核酸序列 的多核苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中 SEQ ID NO:8的第367个碱基是C或T;ix)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO:9的核酸序 列的多核苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其 中SEQ ID NO:9的第253个碱基是A或T;x)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO: 10的核酸 序列的多核苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸， 其中SEQ ID N0:10的第150个碱基是C或G;和xi)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:11 的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续 核酸，其中SEQ ID NO: 11的第249个碱基是A或G。
[0011] 根据另一个例示性的实施方案，提供了多核苷酸，其与上述多核苷酸或其互补多 核苷酸特异性杂交。
[0012] 根据又一个例示性的实施方案，提供了用于牙鲆中的性别测定的试剂盒，其包含 上述多核苷酸，或能够扩增上述多核苷酸的引物对。
[0013] 根据又一个例示性的实施方案，提供了用于牙鲆中的性别测定的方法，该方法包 括：从雌性和雄性牙鲆提取基因组DNA ;使用提取的DNA作为模板用能够扩增上述多核苷酸 的引物对扩增包含单核苷酸多态性（SNP)的多核苷酸；并鉴定多核苷酸的基因型。
[0014] 根据又一个例示性的实施方案，提供了用于测定形态学雄性中的假雄性的方法， 其包括：通过经由对成年牙鲆的腹部压迫测定睾丸的存在和缺乏选择形态学雄性；从选择 的形态学雄性提取基因组DNA;使用能够扩增下文描述的多核苷酸的引物对和提取的基因 组DNA作为模板扩增包含单核苷酸多态性的下文描述的多核苷酸；并鉴定多核苷酸的基因 型；用于测定牙鲆中的性别的DNA多核苷酸或与其互补的多核苷酸选自下组：
[0015] i)多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO: 1的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单核 苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID NO: 1的第523个碱基是 C或T ;
[0016] ii)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:6的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单 核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:6的第150个碱基 是A或T ;
[0017] iii)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:7的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单 核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:7的第322个碱基 是C或G ;
[0018] iv)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:9的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单 核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:9的第253个碱基 是A或T ;
[0019] v)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:10的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单 核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID N0:10的第150个碱 基是C或G ;和
[0020] vi)多核苷酸，其选自具有SEQ ID N0:11的核酸序列的多核苷酸，并且具有包含单 核苷酸多态性（SNP)区的10至100或更多个连续核酸，其中SEQ ID NO: 11的第249个碱 基是A或G。
[0021] 附图简述
[0022] 根据结合附图采用的下述描述，可以更为详细地理解例示性的实施方案，其中：
[0023] 图1的图显示了基于通过雄性和雌性牙鲆的基因组的比较分析鉴定的SNP标志 物，24条染色体的基于SNP的图谱，其中红色棒标示雌性SNP区，而蓝色棒标示雄性SNP区；
[0024] 图2的图显示了来自雌性牙鲜的SNP#9标志物的电泳图（electropherogram);
[0025] 图3的图显示了来自雌性牙鲆的SNP#10标志物的电泳图；和
[0026] 图4的图显示了来自雌性牙鲆的SNP# 11标志物的电泳图。
【具体实施方式】
[0027] 术语的定义：
[0028] 如本文中使用的，术语"牙鲜"指属于鲜科（Family Paralichthyidae)，鱗目 (Order Pleuronectiformes)的咸水鱼，其具有扁平的身体，眼聚集于左侧，并且也称作比 目鱼（flatfish)。牙鲆从潮汐集合的地方到具有1，000m深度的深海生活，并且具有从具有 约5cm的体长的小型类型至具有80cm长度的类型的许多物种。尾鳍在背鳍和臀鳍上明显 分开，并且眼定位的体色是褐色或暗色，而相反侧的颜色是白色。牙鲆的产卵季在二月和七 月之间，并且它在南方地区可以略早。在产卵季期间，牙鲆随潮汐移到水平面20至70m处 的沙泥/沙砂烁或岩石区（sandy mud/sandy gravel or rocky area)并产卵。
[0029] 如本文中使用的，术语"产雌二倍体（gynogenetic diploid) "指二倍体个体，其仅 由完全除去雄性的遗传因素后的雌性遗传材料构成，并且可以通过抑制第二极体的释放制 备具有高遗传纯度的产雌个体。此外，在性别测定培养物中，在雌性是纯合子（XX)时，通过 该机制诱导的所有个体变为雌性。在韩国培养的牙鲜或红海鲷（red seabream)等的情况 中，雌鱼的生长速率较快，并且如此目前通过该机制实施种子生产。
[0030] 如本文中使用的，术语"假雄性（pseudomale) "指个体牙鲆，其在遗传上作为雌性 出生，但是可以通过在性别分化期（大致在孵化的60天之前和之后）在高温水或低温水中 培养来转化成具有睾丸的雄性。因而，通过寻找母本（mother)(假雄性）（其在遗传上是雌 性，但是在形态学上是雄性），并与雌性育种，可以产生遗传雌性种子，并且如此可以在种子 生产