一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法
【专利说明】一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法。
【背景技术】
[0003]青色荧光蛋白(CFP)是一种发光蛋白GFP的一个突变体，与gfp的区别只是最大激发光波长和发射光的波长不同，发青色荧光，常被用于生物领域的报告基因。将CFP导入待标记的菌株或细胞中，可直接观察发光状况。其荧光表达和遗传特性稳定，荧光检测方便且不会对菌体产生不良影响。应用荧光显微镜可以对标记菌和宿主进行长期监测。用于荧光观察的仪器主要有紫外灯、荧光比色仪、荧光正置或倒置显微镜、体式荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等。用紫外灯照射菌落或菌液，可直接观察荧光菌发出的荧光，可以快捷的平板计数;荧光显微镜适合对标记菌切片进行直接、实时地检测;共聚焦激光扫描显微镜具有高分辨率及三维成像功能。体式荧光显微镜可得到三维立体图像，无需制作切片，可直接观察。关于上述检测方法的应用较多，但将体式荧光显微镜与紫外灯结合共同对样品进行检测的应用较少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，是在青色荧光CFP标记目标根瘤菌后，于苜蓿生殖生长期内取样，再进行平板数量检测和体式荧光显微镜检测。
[0006]进一步的，上述的一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，包括以下步骤:
1)取样:分别于苜蓿生殖生长期的蕾期、初花期、结荚期，采用根部浇灌、切根浇灌、添加苦参碱菌液浇灌和花部喷射4种接种方法接种青色荧光CFP标记的目标根瘤菌，于接种后的5d、15d、30d、60d取样检测分析，直至种子收获;其中:取苜蓿单株，随机分离出5-lOcm深土层的毛根、侧根皮层、侧根中柱;莖、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、荚果皮和种子;取样用自来水冲洗干净后自然晾干；
2)平板数量检测:在无菌环境下，分别将各部位取样品称取lg，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入2500mg/L放入碘伏消毒液淹没，震荡消毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现;将完全消毒的组织分别置于无菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心时间为5min，转速为4000rpm/min，吸取
0.2ml上清液均匀涂布于根研磨液依次稀释lOllO3的TY固体培养基，重复三次，28°C培养24h后，观察每皿内荧光标记菌数量，每个培养皿内菌落数采用SC6+安菌落计数器计数；
3)体式荧光显微镜检测:黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色；显微镜检测取样方法与步骤2)平板数量检测方法相同，采用体式荧光显微镜检测，绿光激发，滤片FS47，将样品置于体式荧光显微镜载物台上观察照相。
[0007]进一步的，上述的一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，所述TY培养基的组成及制备方法为:胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaCl2.6H2O 1.3g/L、琼脂15g/L，pH 至 7.0，121°C 灭菌 26min。
[0008]本发明的有益效果为:本发明提供的一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，具有以下优点:
1)手提紫外灯操作简单，结果容易观察；
2)取样、分离后表面灭菌消毒的各器官无菌操作台内研磨、涂抹，手提紫外灯可以计数发光根瘤菌数量;取样简单，检测方法方便，研磨过程轻松较快，两种检测方法结合更加准确判断根瘤菌在苜蓿体内运移及定殖状况；
3)取样、分离后的苜蓿器官表面消毒后可实时应用黑白体式荧光显微镜进行检测，SP可得到三维立体照片，无需制作切片，可直接观察。
【附图说明】
[0009]图1为紫外灯(336nm)检测结荚期切根浇灌侧根中柱(A)、侧根皮层(B)和毛根(C)内荧光标记根瘤菌数量。
[0010]图2为体式荧光显微镜下观察根部荧光标记根瘤菌定殖，其中A毛根;B皮层;(:中柱。
[0011]图3为体式荧光显微镜下观察花期根部浇灌花(A)和紫外灯下(336nm)检测切根浇灌荚果皮(B)内荧光标记根瘤菌定殖。
[0012]图4为体式荧光显微镜下观察蕾期苦参碱菌液浇灌下部茎(A)和根部浇灌下部叶(B)内荧光标记根瘤菌定殖。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:
一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，是在青色荧光CFP标记目标根瘤菌后，于苜蓿生殖生长期内取样，再进行平板数量检测和体式荧光显微镜检测，其具体过程包括以下步骤:
1)取样:分别于苜蓿生殖生长期的蕾期、初花期、结荚期，采用根部浇灌、切根浇灌、添加苦参碱菌液浇灌和花部喷射4种接种方法接种青色荧光CFP标记的目标根瘤菌，于接种后的5d、15d、30d、60d取样检测分析，直至种子收获;其中:取苜蓿单株，随机分离出5-lOcm深土层的毛根、侧根皮层、侧根中柱;莖、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花(花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药)、荚果皮和种子;取样用自来水冲洗干净后自然晾干。
[0014]2)平板数量检测:在无菌环境下，将收取的苜蓿各组织根、茎、叶样品，各称取lg，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入碘伏消毒液淹没，使有效碘浓度为2500 mg/L，震荡消毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现即可;将完全消毒的组织分别置于无菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心时间为5min，转速为4000rpm/min，吸取0.2ml上清液均勾涂布于根研磨液依次稀释lOllO3的TY固体培养基，重复三次，28°C培养24h后，观察每皿内荧光标记菌数量，每个培养皿内菌落数采用SC6+安菌落计数器计数。可以观察到各时期各分离部位均可以检测出荧光标记根瘤菌，地下各器官内数量高于地上器官。地下以蕾期根部浇灌毛根内定殖数量最多，高达8.22X 105cfu/g。地上部各器官内荧光标记根瘤菌数量因接种时期不同而不同，蕾期主要定殖于营养器官，加入苦参碱菌液浇灌接种下部茎内数量最高，达43.30 cfu/g;花期主要定殖于花器内，花部喷射处理花药与荚果皮内荧光标记根瘤菌数量最高，均达8.0Ocf u/花序;结荚期主要定殖于结果内，切根浇灌接种荚果皮内数量最高，达2.20 cfu/花序。
[0015]3)体式荧光显微镜检测:黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色；显微镜检测取样方法与步骤2)平板数量检测方法相同，采用体式荧光显微镜检测，绿光激发，滤片FS47，将样品置于体式荧光显微镜载物台上观察照相。发现苜蓿根、茎、叶及荚果内均可以检测到发光的荧光标记根瘤菌。
[0016]4)图1-图4显示为紫外灯及体式荧光显微镜下观察部分植株器官内荧光标记根瘤菌定殖状况。
[0017]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，其特征在于，是在青色荧光CFP标记目标根瘤菌后，于苜蓿生殖生长期内取样，再进行平板数量检测和体式荧光显微镜检测。2.根据权利要求1所述的一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: .1)取样:分别于苜蓿生殖生长期的蕾期、初花期、结荚期，采用根部浇灌、切根浇灌、添加苦参碱菌液浇灌和花部喷射4种接种方法接种青色荧光CFP标记的目标根瘤菌，于接种后的5d、15d、30d、60d取样检测分析，直至种子收获;其中:取苜蓿单株，随机分离出5-lOcm深土层的毛根、侧根皮层、侧根中柱;莖、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、荚果皮和种子;取样用自来水冲洗干净后自然晾干； .2)平板数量检测:在无菌环境下，分别将各部位取样品称取lg，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入2500mg/L的碘伏消毒液淹没，震荡消毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现;将完全消毒的组织分别置于无菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心时间为5min，转速为4000rpm/min，吸取.0.2ml上清液均匀涂布于根研磨液依次稀释lOllO3的TY固体培养基，重复三次，28°C培养.24h后，观察每皿内荧光标记菌数量，每个培养皿内菌落数采用SC6+安菌落计数器计数； .3)体式荧光显微镜检测:黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色；显微镜检测取样方法与步骤2)平板数量检测方法相同，采用体式荧光显微镜检测，绿光激发，滤片FS47，将样品置于体式荧光显微镜载物台上观察照相。3.根据权利要求2所述的一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，其特征在于，所述TY培养基的组成及制备方法为:胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaCl2.6H2O.1.3g/L、琼脂15g/L，pH至7.0，121°C灭菌26min。
【专利摘要】本发明公开了一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，是在青色荧光CFP标记目标根瘤菌后，于苜蓿生殖生长期取样，再进行平板数量检测和体式荧光显微镜检测。本发明提供的一种苜蓿植株体内运移和定殖目标根瘤菌的检测方法，具有以下优点：1）手提紫外灯操作简单，结果容易观察；2）取样、分离后表面灭菌消毒的各器官无菌操作台内研磨、涂抹，手提紫外灯可以计数发光根瘤菌数量；取样简单，检测方法方便，研磨过程轻松较快，两种检测方法结合更加准确判断根瘤菌在苜蓿体内运移及定殖状况；3）取样、分离后的苜蓿器官表面消毒后可实时应用黑白体式荧光显微镜进行检测，即可得到三维立体照片，无需制作切片，可直接观察。
【IPC分类】C12Q1/06, C12Q1/04
【公开号】CN105441526
【申请号】CN201510891374
【发明人】师尚礼, 苗阳阳
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月8日