一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP及其编码蛋白与应用
【专利摘要】本发明公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP及其编码蛋白与应用，属于植物基因工程技术领域。该抗寒基因MsZFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；由紫花苜蓿抗寒基因MsZFP编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。它包含762bp的开放读码框，编码253个氨基酸，预测的分子量约为27.8kDa。本发明将所述基因导入到烟草中，通过对获得的转基因烟草的研究表明该基因能增强植物抗寒性。该发明为研究苜蓿抗寒分子机理提供理论依据具有广泛的应用前景。有利于发掘出紫花苜蓿抗寒相关基因，利用基因工程手段创建抗寒苜蓿新种质，改良现有品种的抗寒性。
【专利说明】
一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用
技术领域
[0001]本发明属于植物基因工程技术领域，涉及紫花苜蓿基因 MsZFP的克隆及其在增强 植物抗寒性中的应用，具体涉及一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用。
【背景技术】
[0002] 植物的正常生长和代谢会受到很多生物和非生物胁迫的影响。凡对植物生长与生 存不利的环境因子，统称为逆境。其中，非生物胁迫中的干旱、盐害和冷害是影响植物生长 发育的主要三大非生物逆境因子，已成为制约农业生产发展的一个全球性问题。据统计，和 正常生长作物相比，这三大非生物胁迫因子每年使全球作物减产至少在50%以上。在我国 寒冷对作物生长影响尤为严重，已制约着某些地区农业生产和农业经济发展。因此，改良和 培育适应不同环境地区生长的植物新品种具有重要意义。
[0003] 紫花苜蓿是世界上栽培最早，也是最为重要的一种多年生优质豆科牧草。在我国 紫花苜蓿由于北方寒冷漫长的冬季，普遍存在越冬率低的现象，容易发生冻害和死亡，从而 造成大面积减产。低温已成为限制我国北方苜蓿产业发展的主要因素之一，因此研究苜蓿 的抗寒性具有重要的理论和实际意义。
[0004] 近年来在植物抗寒性研究机理及紫花苜蓿抗寒基因工程方面的研究取得了显著 的进展。研究发现，植物对各种不利环境因子具有一定的抵抗能力，并不是被动的接受逆 境，植物具有一定的抗逆性。在植物长期的进化过程中，植物和低等生物适应逆境的一个重 要策略是即时大量表达多种逆境诱导蛋白，如转录因子、蛋白激酶、解毒酶、水分通道蛋白、 胚胎发育晚期丰富蛋白和渗透调节物质合成酶等。这些蛋白的表达及产物的相互作用提高 了植物对逆境的适应能力。
[0005] 锌指蛋白是一类转录因子具有手指状的结构域，在细胞分化、基因表达调控、胚胎 发育、增强植物抗逆性等方面具有重要作用。根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要 分为C2H2型、C4型和C6型。其中C2H2型占大多数，逆境胁迫会诱导植物中许多C2H2型锌指蛋 白的表达，这些锌指蛋白可以直接参与上游抗逆信号的传导，也可以通过特异性识别激活 植物基因组中许多抗逆基因的表达，从而提高植物抗逆性，说明锌指蛋白可以作为提高植 物抗寒性的候选基因。然而目前的研究中，还没有关于紫花苜蓿ZFP基因在抗寒等生理功能 方面的报道。因此，对紫花苜蓿ZFP的克隆和功能研究可进一步揭示苜蓿抗寒机制，对苜蓿 品种改良具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用。
[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0008] 本发明公开了一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP，通过PCR方法从紫花苜蓿中克隆得到 ZFP基因全长cDNA，该抗寒基因 MsZFP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
[0009] 该抗寒基因 MsZFP是与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因，基因全长762bp，编码253 个氨基酸残基，分子量为27.8kDa。
[0010]本发明还公开了上述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序 列如SEQ.ID.N0.2所示。
[0011]本发明还公开了含有上述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP的表达载体，该表达载体为 PCBM-35S-ZFP，所述表达载体中含有草丁膦筛选标记基因 PPT和组成型启动子35S。
[0012] 本发明公开了上述紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的 应用。
[0013] 具体为：构建上述紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP的植物表达载体，再将所构建的植物表 达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织中，筛选获得抗寒性增强的植株。具体步骤为：1) 将苜蓿MsZFP基因核苷酸序列置于CaMV35S启动子之后，构建植物表达载体;2)将表达载体 转入大肠杆菌Top 10感受态细胞;3)利用2)获得的转化子转化烟草，并获得转基因植株。
[0014] 本发明还公开了上述蛋白在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0016] 本发明公开的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP及其编码蛋白与应用，通过PCR方法从紫花 苜蓿中克隆得到ZFP基因全长cDNA，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，其编 码的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本发明首次公开的紫花苜蓿锌指蛋白基因 MsZFP，是与低温相关的C2H2型锌指蛋白基因，本发明运用基因工程技术证实了紫花苜蓿抗 寒基因 MsZFP可以有效改善植物的抗寒性，在提高植物抗寒性和牧草品质改良方面具有重 要的应用价值。
[0017] 本发明的紫花苜蓿MsZFP能够应用于植物抗寒，将含有本发明MsZFP基因的植物表 达载体PCBM-35S-ZFP导入到烟草中，培育筛选得到过表达转基因植物，对获得的转基因植 株进行表型分析，结果显示，与野生型相比，转基因植株具有更强的抗寒性。综上所述，本发 明获得的MsZFP是一种锌指蛋白，在提高植物抗寒性和牧草品质改良方面具有重要的应用 价值。
【附图说明】
[0018] 图1为MsZFP的蛋白结构域；
[0019] 图2为MsZFP与其它物种蛋白质聚类树；
[0020] 图3为植物表达载体PCBM-35S-ZFP构建示意图；
[0021]图4为转MsZFP基因抗性苗的PCR鉴定；
[0022]图5为MsZFP转基因烟草与野生型烟草在低温迫处理下的表型实验结果；
[0023]图6为低温胁迫条件下转MsZFP基因植株与野生型的电导率；
[0024] 图7为qRT-PCR分析阳性株系的MsZFP表达量结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0026] 本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例 中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 1、一种紫花苜蓿锌指蛋白转录因子基因 MsZFP全长cDNA克隆
[0028] 本研究克隆的锌指蛋白MsZFP也属于C2H2型，是两个单C2H2型的锌指蛋白，且具有 典型植物特异基序"QALGGH"。
[0029]保存并搜索从NCBI(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)数据库中搜索的漠藜苜蓿 EST序列，在BioEdit软件中用蒺藜苜蓿EST序列文本文件与数据库中已知的拟南芥AtZFP序 列进行Local Blast，从而获得蒺藜苜蓿中ZFP基因的EST序列。利用该序列设计引物，引物 为：
[0030] ZFP-F1:5 '-ACCAAGTCACCAACTCAATC-3 '
[0031 ] ZFP-R1:5 '-ACCGTTTCATTGTCTTC-3 '；
[0032] 具体流程如下：
[0033] 总RNA提取和cDNA合成：
[0034]利用TRIZ0L试剂盒提取紫花苜蓿叶片RNA，反转录为cDNA，并以合成的cDNA为模板 进行PCR扩增，得到MsZFP全长序列。
[0035] 用KOD-plus DNA聚合酶(Toyobo)进行PCR反应，反应程序：94°C预变性5min;94°C 变性30sec;53.5°C退火30sec;72°C延伸lmin5sec;30个循环；72°C延伸10min。将胶回收得 到的PCR产物连接到pMD18-T中的EcoRV位点，重组质粒转化到大肠杆菌ToplO中，送上海生 工对其进行测序。
[0036] 测序得到MsZFP基因0RF全长序列。基因 cDNA全长762bp，该基因编码253个氨基酸， 蛋白分子量约为27.8kDa。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与MtZFP(Medicago truncatula.L)相比，氨基酸同源性为76%，具备2个保守的单C2H2型结构域，如图1所示。通 过对其它物种中近源基因的比对及进化树构建可见，紫花苜蓿ZFP基因与大豆、花生等物种 中近源基因的亲缘关系较近，结果见图2。
[0037] 2、紫花苜蓿锌指蛋白转录因子MsZFP表达载体的构建
[0038] 植物表达载体pCBM-35S-ZFP的构建：
[0039] 1)以本发明中MtZFP的cDNA序列，设计引物如下：
[0040] ZFP-F1:5 '-ACCAAGTCACCAACTCAATC-3 '
[0041 ] ZFP-R1:5 '-ACCGTTTCATTGTCTTC-3 '；
[0042]以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增MsZFP基因序列；
[0043]反应条件： 94G：C Smin 94eC 30 s 53.5°C 30 s
[0044] 72°C 65 s 30 cycles 72°C 10 min 4°C forever 。
[0045] 2)用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，并将回收的PCR产物与pMDl 8-T 载体连接，将连接后得到的产物转化大肠杆菌感受态ToplO,挑选得到的阳性克隆提取质粒 送测序，将测序后确定的阳性克隆用于后续实验；
[0046] 3)将pCBM质粒用Pst I、Sac I进行酶切，用琼脂糖凝胶试剂盒对目的片段进行回 收，同时用Pst I和Sac頂每切连接在PMD18-T载体上的ZFP片段，然后用同样的方法进行回 收。将回收的ZFP片段与pCBM载体片段连接，最后转化感受态细胞ToplO,获得重组克隆，通 过酶切和PCR检测后将阳性克隆命名为pCBM-ZFP，载体图如图3所示。
[0047] 3、转基因烟草的获得及鉴定
[0048] 1)将重组过表达载体pCBM-35S-ZFP经农杆菌介导的叶盘法转化转入烟草中
[0049] 将经过菌落PCR鉴定的农杆菌单菌落分别接种于10ml YEB(加入50mg/L Kan+ 50mg/L Str+50mg/L Rif)液体培养基中，于28 °C摇床，200rpm过夜培养至0D_值0 · 5-0 · 6， 将其按1:10的比例转入50ml液体YEB培养基中，振荡培养至在0D6QQ值0.4-0.6时，用50ml无 菌的大离心管收集菌体，用液体MS培养基悬浮。
[0050] 将上述得到的重组载体PCBM-35S-ZFP经农杆菌介导的叶盘法转入烟草中，具体操 作步骤:在超净工作台内，将叶片切成lcm见方的外植体小块置于菌液中浸泡8min中，期间 不断震荡。将取出的外植体置于无菌滤纸上吸去多余菌液，叶面朝下接种于芽诱导培养基 A1上，在25°C条件下暗培养2-3d。然后接种到筛选培养基A2上，每20天更换一次筛选培养 基。经过侵染的外植体长出不定芽时，转入生根培养基A3中。
[00511使用培养基如下：
[0052] Al:MS+1.0mg/L 6-BA+O.lmg/L NAA
[0053] A2：MS+1.0mg/L 6-BA+O.lmg/L NAA+500mg/L Cef+1.lmg/L PPT
[0054] A3：MS+500mg/L Cef+1.3mg/L PPT
[0055] 用PCR方法对筛选培养基中生根的不定芽进行鉴定，以进一步确认产生的转基因 植株确实含有ZFP基因。
[0056]首先采用CTAB法提取植物基因：取适量植物叶片置于1.5ml离心管中加入液氮，用 研棒研磨呈粉末状；加入800μ1预热的2xCTAB缓冲液（100mM Tris-Hcl pH 8.0,20mM EDTA pH 8.0,2%CTAB，1.4M Nacl)，65°C水浴加热45分钟后取出冷却至室温；13000rpm离心 15min取上清加入等体积的酸和氯仿，颠倒混勾，4°C12000rpm离心10min取上清至1.5ml离 心管中；加入与上清等体积的氯仿-异戊醇颠倒混勾，4°C、12000rpm离心10min取上清至 1.5ml离心管中，加入1/10体积醋酸钠和2.5体积无水乙醇，混匀后至于-20°C醇沉30min; 4<€、12000印111离心10111；[11后弃上清，加入70%乙醇40(^1，4°0、12000印1]1离心10111；[11后干燥，用 25μ1纯水溶解。
[0057] 2)转MsZFP基因烟草PCR检测
[0058] PCR鉴定，MsZFP基因内部引物如下：
[0059] Primer 1:5'-TTCCCATCTTATCAAGCACT-3'
[0060] Primer 2:5'-GCACCACCGAATCCAACC-3'
[00611反应条件： 94°C 5min 94aC 30 s 52.5°C 30 s
[0062] 720:C '24 s 30 cycles 72°C 10 min 4°C forever 〇
[0063]以植物基因组DNA为模板，用MsZFP基因上下游特异引物作PCR检测，成功转入 MsZFP基因的植株均能扩增出约390bp的条带，结果参见图4,琼脂糖凝胶电泳结果显示编号 1-12为PCR获得的目的条带，与阳性一致(即能扩增出大约390bp的目标DNA条带），为转基因 植株。其中，"+"为阳性对照，为阴性对照（即以野生型植株基因组DNA为模板的PCR检测 结果），0为空白对照。RT-PCR分析目的基因在转基因阳性株系中的转录情况，从转基因植株 中提取总RNA，并反转录成cDNA，用作RT-PCR的模版，以此来检测MsZFP基因在转基因植株中 的转录水平。结果证明转基因植株均有目的基因的转录物，而野生型植株则没有。结果如图 7所示，筛选出MsZFP表达量较高的阳性植株3个株系分别是0X1、0X3、0X4,以0X3为例作后续 实验。
[0064] 4、转MsZFP基因烟草植株抗寒性分析
[0065] 1)将生根8周的转基因烟草苗与同时期栽培生长状况相同的野生烟草苗，置于4°C 处理4h，再将其置于-4 °C处理3h，结果显示转基因烟草与野生型烟草相比受低温胁迫损伤 小，说明转基因植株抗寒能力比野生型强，处理之后的表型参见图5。
[0066] 2)通过测定电导率对质膜透性进行分析。用打孔器在转基因阳性烟草叶片叶脉两 侧取10个小圆片于20mL专用刻度试管中，加入去离子水至刻度处，然后用真空栗抽出细胞 间隙中的空气，分两次抽气，每次抽气15min共抽气30min。将试管取出静置20min，然后轻轻 晃动叶圆片。在室温下，用电导仪测定电导率。将试管置于l〇〇°C沸水浴15min，以杀死植株 组织，自然冷却至室温后加去离子水至刻度处，在20-25Γ恒温下，用电导仪测定其煮沸电 导率。
[0067]用：细胞膜伤害率=处理电导率/煮沸后电导率X 100%，来表示细胞质膜透性的 大小。结果参见图6,相对非转基因的野生型植株，转MsZFP基因烟草叶片细胞质膜受损伤程 度较轻，在冷胁迫下质膜透性增加明显较缓慢，且幅度较小。t-检验显示p〈0.05,转基因组 与对照组的差异显著，说明转基因烟草对低温的抗性要比野生型强。
[0068]综上所述，本发明公开了MsZFP基因核苷酸序列及编码的蛋白质氨基酸序列， MsZFP基因全长762bp，编码253个氨基酸残基的蛋白。本发明通过对紫花苜蓿ZFP基因的分 离和功能鉴定，确定了MsZFP基因在改良植物抗寒性方面的作用。实验发现该基因能够提高 烟草抗寒性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。该发明为研究苜蓿抗寒分子机 理提供理论依据具有广泛的应用前景。有利于发掘出紫花苜蓿抗寒相关基因，利用基因工 程手段创建抗寒苜蓿新种质，改良现有品种的抗寒性。
【主权项】
1. 一种紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP，其特征在于，该抗寒基因 MsZFP的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.1 所示。2. 如权利要求1所述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP，其特征在于，该抗寒基因 MsZFP是与低 温相关的C2H2型锌指蛋白基因。3. 如权利要求1所述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP，其特征在于，该抗寒基因 MsZFP全长 762bp，编码253个氨基酸残基，分子量为27.8kDa。4. 由权利要求1所述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨 基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。5. 含有权利要求1所述的紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP的表达载体，其特征在于，该表达载 体为 PCBM-35S-ZFP。6. 如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有草丁膦筛选标记基 因 PPT和组成型启动子35S。7. 权利要求1紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，构建含有权利要求1所述紫花苜蓿抗寒基因 MsZFP的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织中， 筛选获得抗寒性增强的植株。9. 权利要求4所述的蛋白在提高紫花苜蓿对环境抗寒性能中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK105838723SQ201610362827
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】郭长虹, 陈月, 宋丽莉, 崔慧萍, 张雪
【申请人】哈尔滨师范大学