一种用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用单链脱氧核糖核酸进行信息存储和加密的方法。该单链脱氧核苷酸的特征在于两端为固定核苷酸序列区间，中间部分为信息存储核苷酸序列区间。固定序列区间的设计为方便信息归类和提取，长度在几个到几百个核苷酸，固定序列区间含有PCR扩增的引物结合序列，并含有限制性核酸内切酶的作用位点，便于PCR扩增和克隆测序，同时可增加DNA条形码(DNA barcode)序列用于信息分类。中间信息存储序列用于信息的存储，其长度可根据存储的信息长短，效益成本，可操作性等实际因素可以进行调整。目前国内外还没有报道利用单链脱氧核糖核酸于信息加密，存储和防伪。
【专利说明】
一种用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种单链脱氧核糖核酸的制备，以及其用于防伪 标签，溯源鉴定，信息加密和存储的用途。
【背景技术】
[0002] 造假作为当今世界上增长最快的经济犯罪之一，对正当的商业活动、公共卫生与 健康和安全秩序等带来了极大的危害。以欧盟为例，假货和包装造假的规模都在日益加大， 国际防伪联盟调查发现，全球零售行业每年因造假而蒙受的损失达2000亿美元，全球商品 因被造假而遭受的损失每年高达1万亿美元。
[0003] DNA防伪，是指利用不同的DNA具有不同编码，使产品含有某个确定的DNA并能长久 保存。如果在产品中能检测到这种DNA，就能验证产品的真伪。脱氧核糖核酸(DNA)具有的序 列专一性及复杂性，将DNA进行处理，使得DNA可植入到各种防伪材料中。DNA在商品防伪应 用中十分简单，胶，水、油呈、酒、化妆品，奢侈品，机密文件、有价证券、身份证等中都可以使 用这一技术。在生产工艺中，以水为媒介掺入DNA是十分便利的，其加工成本低廉。由于DNA 同时又十分稳定，一般商品的防伪采用DNA理论上不存在保存期的问题。由于复杂性，对于 仿冒者来说，要破解和仿制这些密码却要很长时间。
[0004] 相较于传统的防伪手段，DNA防伪的优势很多。首先，这项技术具有唯一性，保密性 极高。作为一种密码标志，只要将DNA样本应用于被保护对象上，就可赋予非生物品一个生 物的基因标志，这使得造假变得几乎不可能。因为造假者不了解DNA样本的序列，无法合成 DNA样本。其次，DNA防伪技术安全可靠，应用领域广泛。它可以与油墨、丝线、化妆品、饮料等 很多材质的原材料结合，无毒无害，不会对人体造成任何伤害，几乎可以用于各领域的防 伪。
[0005] DNA防伪通常分为生物DNA防伪和人工合成DNA防伪两类，目前使用较多的生物DNA 防伪，是指将动植物的DNA通过萃取、提炼、剪接、合成等步骤，由遗传工程处理后，再经特殊 的工艺流程，使DNA能在常态下长久保存下来。但是生物DNA防伪工艺繁琐，成本高昂，限制 了应用。由于DNA合成技术的革新，新技术得产生极大地提高了DNA合成的效率，降低了DNA 合成的成本，所以人工合成DNA防伪将成为未来DNA防伪的趋势。然而先前的方法是人工合 成一段随机的双链DNA序列，由于在实际应用中，DNA往往会有很大程度的丢失，残余的DNA 不通过PCR扩增再测序的方法，往往很难追溯鉴定。同时双链的DNA为设计多种PCR扩增方 法，DNA测序手段提供了便利，增加了隐藏的DNA密码被破解的可能性。
[0006] 本发明通过设计使用一种特殊的单链脱氧核苷酸序列，其中引入中间信息存储序 列区间，提升了传统DNA防伪标签技术的复杂性和信息存储容量，同时相比于现有方法更加 经济，方便制作。固定序列区间的设计，方便信息分类和快速提取，可以在极少量的DNA样本 条件下通过PCR扩增放大，而对于存储的信息溯源鉴定。本发明与现有传统的电码防伪、激 光防伪、二维码防伪等技术相结合，将极大扩宽DNA防伪技术的适用范围。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人工合成的单链脱氧核糖核 酸制备方法，增加了传统DNA防伪标签技术的复杂性和信息存储容量，同时增加了信息提取 的快捷性，相比于现有方法更加经济，方便制作，可以在极少量的DNA样本条件下通过PCR扩 增放大，而应用于信息加密存储，溯源鉴定。目前国内外还没有报道利用单链脱氧核糖核酸 于信息加密，存储和防伪。
[0008] 为了达到上述目的，本发明涉及技术方案是这样实现的：
[0009] 设计的单链脱氧核糖核酸序列的两端为固定核苷酸序列区间，中间部分为信息存 储核苷酸序列。其中固定区间的设计为方便信息提取和分类，长度一般在几个到几百个核 苷酸。固定序列区间含有PCR扩增的引物结合序列，并含有限制性核酸内切酶的作用位点， 便于PCR扩增和克隆测序。同时可增加 DNA条形码(DNA barcode)序列用于信息分类。中间序 列用于信息的存储，其长度可根据存储的信息长度，效益成本，可操作性等实际因素可以进 行调整。中间序列能形成的核苷酸链的种类是4的η次方，η是中间序列中的核苷酸的碱基 数。随着中间序列的长度增加，核苷酸链的种类也随之增加，所能存储的信息容量亦可以增 加。具体对应核苷酸序列可根据存储信息和用户要求等因素而进行调整。
[0010] 所述的单链脱氧核糖核酸的用途，用于与多种媒介相结合，如油墨、颜料、胶水、塑 胶、化妆品、丝线、饮料、药品胶囊等，而制备可应用于各行业的防伪制品。同时与机密文件、 有价证券、身份证，贵重物品相结合用于信息保密，长期保存。理论上，可以把各种数字化信 息转化为核苷酸编码信息而进行信息加密和长期存储。
[0011] 本发明的用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸，具有DNA防伪技术的通用特 点，如：1，立即辨识，使用方便:单链脱氧核糖核酸涂抹处，可在紫外灯下或者蓝光灯下发出 荧光，以辨识产品真伪。2，应用广泛:单链脱氧核糖核酸可与许多媒介相结合，如油墨、颜 料、胶水、塑胶、化妆品、饮料等，几乎可应用于各行业的防伪;3、安全可靠:单链脱氧核糖核 酸分子无毒，对人体不会有任何伤害，可应用于各类食品、药品及保健品的生产;4、价格普 及。
[0012]相比于传统的DNA防伪技术，本发明还极大的提高了传统技术的复杂性和信息存 储容量，同时相比于现有方法更加经济，方便解码和鉴定，将有助于开发应用更加广泛和系 统的DNA防伪技术，信息加密和存储系统。
[0013] 本发明的主要优点和有益效果：
[0014] 人工合成的单链脱氧核糖核酸不但和传统DNA防伪技术一样具有方便使用，应用 广泛，安全无毒可靠，价格低廉等优点。在设计该防伪和加密技术中，创新性地使用了中间 信息存储序列区间，用于信息存储和加密，增加了DNA序列的复杂性，序列未知的单链脱氧 核酸无法轻易使用传统的PCR扩增和DNA测序方法进行解码。两端为固定序列区间，从里到 外依次对应PCR扩增引物结合区间，酶切位点和DNA barcode序列，方便信息校验时的提取， 解码鉴定和信息分类。由于序列是单链短DNA序列，在模板序列和引物序列未知的情况下， 增加了利用传统分子生物学方法进行解码的困难性。本发明对于DNA防伪技术，信息加密和 存储具有重大意义。
[0015] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0016] 图1为用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸的设计原理图
[0017] 图2为在蓝光灯下荧光标记的单链脱氧核糖核酸可以发出荧光。
[0018] 图3为利用PCR可以扩增单链脱氧核糖核酸分子。
[0019] 图4为通过基因测序对不同来源的单链脱氧核糖核酸分子进行鉴定。
[0020] 图5为通过高通量测序和生物信息学分析对标记了不同DNA barcode的单链脱氧 核糖核酸分子进行鉴定。
[0021 ]图6为单链脱氧核糖核酸分子可制为油墨涂抹于或惨杂于多种物体。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图对本发明做详细具体的介绍，旨在进一步说明本发明，而非限制本 发明。
[0023] 实施例一，用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸的制备方法
[0024] 参照图1
[0025] 步骤一、设计信息存储区间：首先通过计算机编程把需要存储的任何信息转化为 相应的核苷酸序列，即ATGC编码，作为中间信息存储区间的序列；设计两端固定区间：选定 任一对专一的PCR扩增引物，设计对应的引物结合区间，连接在中间存储区间的上下游两 端，为方便克隆可在PCR引物扩增区间上下游增加酶切位点，最后可依据信息分类，在序列 的两端增加 DNA条形码(DNA barcode)序列，具体设计可参考图1所示。以单链脱氧核酸分子 5' -ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'为例，中间序列的40个碱基为随机 序列，可以用于存储44°种信息。两端5' -ATCCAGAGTGACGCAGCA和TGGACACGGTGGCTTAGT-3'为 PCR引物结合位点。
[0026]步骤二、根据信息分类的需求，可在单链脱氧核糖核酸的两端设计DNA barcode。 以下述的五种序列互不重复的DNA barcode为例，可为单链脱氧核糖核酸的信息加密和存 储系统增加五种不同的分类。
[0027] Barcodel:5，-TCG TAT CG-3'
[0028] Barcode2:5，-TCA CTG AC-3，
[0029] Barcode3:5，-TAT GCA TC-3，
[0030] Barcode4:5，-TAC ACG AG-3'
[0031] Barcode5:5'-TGC GTA CT-3'
[0032] 步骤三、通过DNA自动合成仪，按照核苷酸对应序列顺序合成，可根据具体应用环 境对单链脱氧核糖核酸分子进行各种修饰，最后通过纯化，离心浓缩干燥而制备。
[0033] 实施例二，用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸的信息读取方法
[0034] 参照图2,3，4,5
[0035]步骤一、如图2所示，上述的FITC荧光修饰的单链脱氧核糖核酸分子Y - ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'溶解于蒸馏水中，直接滴到滤纸中央。 在蓝光下可以直接观察到单链脱氧核糖核酸的荧光环状扩散环。单链脱氧核糖核酸具有传 统的DNA防伪技术的立即辨识，使用方便特点，DNA密码标志处，在紫外灯下或者蓝光灯下可 以发出荧光，以辨识产品真伪。
[0036] 步骤二、以5' -ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'和5' -ACTAAGCCACCGTGTCCA-3'为一对PCR 扩增引物，提取滤纸中的单链脱氧核糖核酸分子，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，反应体 系如下：10X buffer(含Mg2+)，5ul;2.5mM dNTP，2ul;10uM PCR引物一对，各lul;PCR模板， 2ul; Taq酶，0 · 5ul; ddH20，38 · 5ul，反应条件如下，95Γ，3min; (95 Γ，30s; 56 · 3 Γ，30s; 72 °C，30s)xl2;72°C，6min。
[0037] 步骤三、扩增后脱氧核糖核酸产物进行琼脂糖凝胶电泳。3%琼脂糖溶解在lx TAE 缓冲液(40mM Tris乙酸，ImM EDTA，pH 8.3)，和SYBR_?凝胶染色1:10000稀释混合。将凝 胶和染色液混合彻底，倒入凝胶室，以制备电泳凝胶。P C R后的D N A产物和6 X的1 〇 a d i n g buffer 6:1的比例混合，加到点样孔，以100V的稳定电压，电泳lh，在凝胶成像系统下观察 照相。如图3所示，可以在凝胶成像电泳系统下，检测到扩增后的DNA条带。
[0038]步骤四、琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段通过胶回收，DNA纯化，进行克隆测序。由 于在PCR扩增中使用Taq DNA polymerase酶，PCR后DNA产物的3'端会产生dA overhangs，通 过blunting enzyme限制酶的处理，反应体系如下：2X Reaction Buffer，10μ1;Νοη_ purified PCR product，lyl;H2〇,6yl;DNA Blunting Enzyme，lyl，反应条件如下，7CTC， 5min，然后冰上冷却，可产生平端的DNA产物。然后使用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，可直接把平端化的DNA产物连接到pJETl. 2/blunt克隆载体，在原来 反应体系加入pJET1.2/blunt Cloning Vector(50ng/yl)，lyl;T4DNA Ligase，lyl，室温孵 育5分钟。因此该单链脱氧核糖核酸不需要添加特定的酶切结合位点序列。连接后的克隆 载体转化到大肠杆菌中进行扩增，然后利用T7测序引物对PCR的产物进行测序，对数据信息 进行鉴定和解码。以包含了一种特定存储信息的单链脱氧核糖核酸为例，通过上述克隆测 序方法，如图4所示，测序结果对比数据库信息，可以有效的区分假冒标示，失真信息和高保 真原版信息。
[0039]步骤五、为了增加信息的分类，可以在单链脱氧核糖核酸两端增加 DNA barcode序 列。以上述的五种DNA barcode为例。把五种不同来源，含有约40万种不同编码信息的单链 脱氧核糖核酸分子5' -ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'，分别标记五种 不同的DNA barcode。标记了五种DNA barcode的单链脱氧核糖核酸分子均勾混合，然后通 过第二代高通量测序进行信息解码和读取，然后通过生物信息学分析，对于所有的测序结 果按照DNA barcode进行分类，然后去除引物结合区间，然后按照核苷酸长度为40bp进行质 量控制，去除测序结果中的长度异常值。如图5所示，如果对单链脱氧核糖核酸进行DNA barcode标记，即使把含有不同来源信息的DNA混合，也可以通过高通量测序和后续的生物 信息分析进行解码和归类，而有效的鉴定和溯源信息。
[0040] 实施例二
[0041] 荧光标记的单链脱氧核糖核酸和透明的指甲油混合均匀，可以制为DNA防伪油墨， 涂抹或者硬刷与各种固体表面。结果如图6所示，荧光标记的核酸可以涂抹于纸张，纺织品， 塑料，在紫外灯下或者蓝光灯下可以发出荧光。
[0042] 结论：
[0043] 1)单链脱氧核糖核酸分子可以立即辨识，使用方便。
[0044] 2)通过特定的PCR引物可以对单链脱氧核糖核酸进行解码鉴定，以区分造假信息， 缺失?目息和尚保真?目息。
[0045] 3)通过增加 DNA条形码(DNA barcode)序列，可以对复杂，多来源的信息进行分类。
[0046] 4)该单链脱氧核糖核酸可以制成DNA油墨与多种商品和介质结合。
【主权项】
1. 一种用于信息存储和加密的单链脱氧核糖核酸，其特征在于， 单链脱氧核糖核酸的两端为固定核苷酸序列区间，中间部分为信息存储核苷酸序列， 固定序列区间的设计为方便信息归类和提取，长度在几个到几百个核苷酸，中间序列区间 用于信息的存储和加密，其长度可根据存储的信息长短，效益成本，可操作性等实际因素可 以进行调整。2. 根据权利要求1所述的单链脱氧核糖核酸，其特征在于，固定序列区间含有PCR扩增 的引物结合序列，并含有限制性核酸内切酶的作用位点，便于PCR扩增，克隆和测序而提取 信息，同时可增加 DNA条形码序列(DNAbarcode)而用于信息分类。3. 根据权利要求1所述的单链脱氧核糖核酸，其特征在于，中间序列区间用于信息存 储，能形成的核苷酸链的种类是4的η次方，η是中间序列中的核苷酸的碱基数，随着中间序 列的长度增加，核苷酸链的种类也随之增加，所能存储的信息容量亦可以增加。4. 一种权利要求1所述的单链脱氧核糖核酸的制备方法，其特征在于， 步骤一、设计信息存储区间：首先通过计算机编程把需要存储的任何信息转化为相应 的核苷酸序列，即ATGC编码，作为中间信息存储区间序列； 步骤二、设计两端固定区间：选定任一对专一的P C R扩增引物（以5 '-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'和5' -ACTAAGCCACCGTGTCCA-3'为例），设计对应的引物结合区间， 连接在中间存储区间的上下游两端（以5Y-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'为例），为方便克隆可在PCR引物扩增区间上下游增加酶切位点， 最后为了增加该加密和存储系统的信息分类，在单链脱氧核糖核酸序列的两端可增加序列 互不重复DNA条形码序列（DNA barcode)(以下述的五种DNA bar code为例，1^1'(：〇(161:5'-TCG TAT CG-3'，Barcode2:5'-TCA CTG AC-3'，Barcode3:5'-TAT GCA TC-3'，Barcode4: 5 '-TAC ACG AG-3 '，Barcode5:5 '-TGC GTA CT-3 '）； 步骤三、通过DNA合成仪，按照核苷酸对应序列顺序合成，可根据具体的应用环境对DNA 分子进行各种修饰，最后通过纯化，离心浓缩干燥而制备。5. -种权利要求1所述的单链脱氧核糖核酸的信息读取方法，其特征在于， 步骤一、用紫外灯或者蓝光灯直接照射涂抹了荧光标记的单链脱氧核糖核酸处，可发 出荧光，而立即读取； 步骤二、以一对PCR扩增引物，提取单链脱氧核糖核酸，进行聚合酶链式反应(PCR)扩 增，以下述的PCR扩增引物5' -ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'和5' -ACTAAGCCACCGTGTCCA-3'为例； 步骤三、扩增后的脱氧核糖核酸产物进行琼脂糖凝胶电泳和成像而鉴定； 步骤四、提取琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，进行克隆测序，对数据信息进行鉴定和 解码； 步骤五、增加了DNA barcode的单链脱氧核糖核酸序列，可通过测序和生物信息分析进 行解码和归类，而有效的鉴定和溯源信息。6. -种权利要求1所述的单链脱氧核糖核酸的应用，其特征在于，应用于防伪标签，溯 源鉴定，信息加密和存储等用途。
【文档编号】C12Q1/68GK105838711SQ201610305707
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】张阳
【申请人】张阳