一种新型3-差向异构酶以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型3?差向异构酶和编码所述多肽的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，生产所述3?差向异构酶以及该3?差相异构酶应用用途的方法。
【专利说明】
[0001] 一种新型3-差向异构酶以及对其进行编码的多核苷酸
技术领域
[0002] 本发明涉及具有3-差向异构酶活性的多肽或蛋白质，编码具有3-差向异构酶活性 的多肽或蛋白质的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的核酸构建体或表达载体，产生 所述酶的方法，和所述酶在多种工业应用中的用途。
[0003] 此外，木发明涉及通过使用具有3-差向异构酶活性的多肽或蛋白质催化果糖、葡 萄糖、淀粉糖等单糖或混合糖生产D-阿洛酮糖的方法，以及使用所述多肽或蛋白质催化山 梨糖、淀粉糖等单糖或混合糖生产D-塔格糖的方法。
[0004] 发明背景 随着人们对健康饮食的日益重视，研发健康安全的低热量功能性甜味剂成为食品行业 研究的重点。D-阿洛酮糖和D-塔格糖作为自然界中天然存在但含量极少的天然低热量功能 性甜味剂，已经成为人们研究的热点。
[0005] D-阿洛酮糖(D-allulose)又名D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖的C-3位的差向异构 体。D-阿洛酮糖是一种天然存在但有含量极少的低热量功能性甜味剂，其甜度为蔗糖的 70%，但能量仅为蔗糖的0.3%，可以用作低卡路里减肥食品的甜味剂，同时，D-阿洛酮糖还 具有抑制肝中脂质合成有关酶活性的功能，有助于减少腹部脂肪堆积，并能一定程度上控 制体重，可以用于健康食品等各种各样的功能性食品。此外，D-阿洛酮糖还能够改善食品 风味、外观等，延长食品的保存期限。因此，D-阿洛酮糖这种健康安全的低热量功能性甜味 剂已获得越来越多学者的关注，成为最具市场竞争力的新型甜味剂之一。
[0006] 由于D-阿洛酮糖是一种较为稀有的天然单糖，从自然界中分离提取产量低，成本 高，难以满足人们作为低热量健康甜味剂的需要，也不适宜工业化大生产的要求，因此为了 应用于食品工业，需要有高效的D-阿洛酮糖生产方法。传统的D-阿洛酮糖生产方法主要为 化学法，生产过程需要消耗大量费用、产生许多副产物和污染物。而生物法制备D-阿洛酮糖 具有反应专一性强，产物组分简单易纯化且属于天然产品等特点，已经成为研究的热点。
[0007] 生物法制备D-阿洛酮糖最为有效的方法是寻找能使果糖转变为D-阿洛酮糖的酶。 然而，目前的阿洛酮糖-3-差相异构酶酶存在高温下稳定性降低或者活性低反应速度慢等 问题，不利于工业化生产D-阿洛酮糖的成本控制。因此，需要开发高温稳定性优良、活性高 的阿洛酮糖-3-差向异构酶以适应工业化生产的需求。
[0008] D-塔格糖(D-Tagat〇Se)，是D-山梨糖的C-3位的差向异构体。D-塔格糖是一种天然 存在但有含量极少的低热量功能性甜味剂，其甜度为蔗糖的92%，在人体内吸收率较低，仅 为20%~25%，不会引起机体血糖水平的明显变化，很适合糖尿病人食用，而且绝大部分塔格 糖直接进入结肠，被其中微生物菌群所选择性发酵，促进有益菌增殖，抑制有害菌的生长， 起到明显的改善肠道菌群的作用，是一种很好的益生素，可以用于健康食品等各种各样的 功能性食品。此外，D-塔格糖还能够改善食品风味、外观等。因此，D-塔格糖这种健康安全 的低热量功能性甜味剂已获得越来越多学者的关注，成为极具市场前景的新型甜味剂之 o
[0009] 使山梨糖异构为D-塔格糖是生物法制备D-塔格糖最为有效的方法之一，这种方法 的关键是寻找能使山梨糖转变为D-塔格糖的酶。目前的塔格糖-3-差相异构酶存在高温下 稳定性降低或者活性低反应速度慢等问题，不利于工业化生产D-塔格糖的成本控制和规模 放大。因此，需要开发高温稳定性优良、活性高的塔格糖-3-差相异构酶以适应工业化生产 的需求。
[0010]
【发明内容】
[0011]本发明人从Thermogemmatispora carboxidivorans菌种发现了一种新型具有3_ 差向异构酶活性的蛋白质。相应地，本发明提供了具有3-差向异构酶活性的新型蛋白质，和 编码所述蛋白质或多肽的多核苷酸。所述蛋白质或多肽具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔 格糖-3-差向异构酶活性。本发明的蛋白质或多肽具有良好的活性和优秀的热稳定性，这两 点对较高温度条件下生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是优良的性能。
[0012] 本发明涉及具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性的分离的 蛋白质或多肽，其选自下组： (a) 蛋白质或多肽，其与SEQ ID N〇:2的氨基酸序列具有至少70%序列同一性； (b) 蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂 交：（i)SEQ ID N〇:l的多肽编码序列，（ii)包含SEQ ID N〇:l的多肽编码序列的基因组DNA 序列，或（iii) (i)或（ii)的全长互补链； (c) 蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 1的蛋白质或多肽 编码序列具有至少70%序列同一性； (d) SEQ ID N0:2的蛋白质或多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插 入的变体;和 (e) 任何(a)、（b)或（c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID N〇:2或由SEQ ID N〇:2组成， 和 (f) (&)，（13)，（〇)，（(1)，或(6)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶 及塔格糖-3-差向异构酶活性。
[0013] 本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞:并涉 及产生多核苷酸的方法。
[0014] 本发明亦涉及酶法生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法。
[0015] 定义 阿洛酮糖-3-差向异构酶活性:术语"阿洛酮糖-3-差向异构酶活性"意指催化果糖的C-3位异构转化为D-阿洛酮糖的活性。
[0016] 塔格糖-3-差向异构酶活性:术语"塔格糖-3-差向异构酶活性"意指催化山梨糖的 C-3位异构转化为D-塔格糖的活性。
[0017]分离的蛋白质或多肽:术语"分离的蛋白质或多肽"意指相对于如见于自然界的蛋 白质或多肽经人力修饰的多肽。在一个方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1%纯，例 如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，并且最优选至少 90% 纯。
[0018] 分离的蛋白质或多肽的非限定性实例包括:（1)任何非天然存在的蛋白质或多肽， (2)任何蛋白质或多肽，其包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，它们至少 部分地从与其在自然界结合的一种或多种或所有天然存在的组分移出；（3)任何蛋白质或 多肽，其相对于见于自然界的蛋白质或多肽经人工修饰:或(4)任何蛋白质或多肽，其通过 相对于与其天然结合的其它组分增加所述蛋白质或多肽的量而受修饰。分离的蛋白质或多 肽可存在于发酵液样品。
[0019] 基本上纯的蛋白质或多肽:术语"基本上纯的蛋白质或多肽"意指蛋白质或多肽制 备物，所述蛋白质或多肽制备物含有按重量计至多10%的与其天然或重组结合的 (associated)的其它蛋白质或多肽材料。优选地，所述蛋白质或多肽是按存在于制备物中 的全部蛋白质或多肽材料的重量计至少90%纯。本发明的蛋白质或多肽优选是基本上纯的 形式，例如，这能够通过以下实现:通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
[0020] 序列同一性:参数"序列同一性"描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间 的相关性。
[0021] 就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度通过使用如EMBOSS软件 包（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， Trends in Genetics 16:276_277)(优选3.0.0版或更高版木）的Needle程序中执行的 Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48:443-453)来测定。 使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)为10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)为0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版）取代矩阵。使用Needle标记为"最高同 一*性(longest identity) 〃的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一,性百分比，并计 算如下： (同样的残基X 100V(比对长度一比对中缺口的总数） 就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度通过使用如EMBOSS软件包 (EMB0SS:The European Molecular Bi010 Open Software Suite, Rice等，见上文）（优选 3 ? 0 ? 0版或更高版本）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman和 Wunsch，1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分为10,缺口延伸罚分为0.5 和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为"最高同一性"的输出 结果(使用-nobrief?选项获得)作为同一性百分比，并计算如下： (同样的脱氧核糖核苷酸X 100V(比对长度一比对中缺口的总数） 片段:术语"片段"意指从成熟多肽的氨基和(或)羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基 酸的多肽;其中所述片段具有3-差向异构酶活性。
[0022] 等位变体(allelic variant):术语"等位变体"意指占据相同染色体基因座的基 因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的 多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序 列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0023] 分离的多核苷酸:术语"分离的多核苷酸"意指相对于见于自然界的多核苷酸经人 力修饰的多核苷酸。在一个方面，分离的多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为1%至95%纯。 所述多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或其任意组合。
[0024] 基本上纯的多核苷酸:术语"基本上纯的多核苷酸〃意指不含其它外来的或不期望 的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生 产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计〇. 5%至10 %的与其天然或 重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非 译区，如启动子和终止子。优选地，基本上纯的多核苷酸是按重量计90%至99.5%纯的。本发 明所述多核苷酸优选为基木上纯的形式。
[0025] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列 的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始 密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、 cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
[0026] cDNA:术语" cDNA "意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、己剪接的 mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的 (initial )、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工然后作 为成熟的己剪接的mRNA出现。
[0027] 核酸构建体:术语"核酸构建体"意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在 的基因，或将其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸 的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时， 术语核酸构建体与术语"表达盒"同义。
[0028]调控序列（control sequence):术语"调控序列"意指对编码本发明多肽的多核苷 酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或 外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前 导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，调控序 列包括启动子以及转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点目的 的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连 接。
[0029] 可操作地连接:术语"可操作地连接"意指这样的构型，其中将调控序列置于相对 于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
[0030] 表达:术语"表达〃包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修 饰、翩译、翻译后修饰和分泌。
[0031] 表达载体:术语"表达载体"意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核 苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
[0032] 宿主细胞:术语"宿主细胞〃意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发 明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的（susceptible) '术语 "宿主细胞〃涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细 胞。
[0033] 变体:术语"变体"意指具有3-差向异构酶活性的蛋白质或多肽，其在一个或多个 (几个)位置包含改变，即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和(或)缺失。取代意指 用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸:缺失意指移出占据某位置的氨基酸;和插入意 指紧邻占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
[0034] 发明详述 本发明人研究了源自Thermogemmatispora carboxidivorans菌的差向异构酶多肽的 特性，在对其进行将果糖转化为D-阿洛酮糖及将山梨糖转化为D-塔格糖的实验时发现，上 述多肽具有使果糖及山梨糖第3个碳位发生差向异构化反应、使其转化为D-阿洛酮糖或D-塔格糖的功能，这是通过以下步骤进行的：合成源自Thermogemmatispora carboxidivorans菌的差向异构酶基因，培养包含所述基因表达载体的微生物，并过表达该 多肽。经过实验，发现该多肽具有良好的阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶 活性和优秀的热稳定性。因此，本发明提供了一种具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3_差向异构酶活性的多肽，并利用所述具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构 酶活性的多肽生产D-阿洛酮糖或D-塔格糖的方法。
[0035] 为了确定该差向异构酶的多肽的特性，在本发明中，通过基因合成从 Thermogemmatispora carboxidivorans菌株中获得该标注为差向异构酶的多肽的基因，所 标注的差向异构酶基因是仅根据DNA碱基序列，而不是根据其功能方面的表征结果所定义 的。然后，将所获得的差向异构酶基因插入到适合的表达载体中，从而产生含有差向异构酶 基因的重组载体，并且将所述重组载体转化到适合的微生物中。将该转化的微生物培养在 发酵培养基中，并在该微生物中过表达所述差向异构酶基因的多肽产物，然后分离和纯化 所述差向异构酶基因的多肽产物，以备用。经过实验，发现该多肽具有阿洛酮糖-3-差向异 构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性，能够转化果糖生成D-阿洛酮糖，也能转化山梨糖生成D-塔格糖。
[0036] 由本发明的方法所产生的新型3-差向异构酶活性的多肽可具有这样的氨基酸序 列，该序列不仅限于SEQ ID N〇:2的氨基酸序列，而且包括由SEQ ID N〇:2的氨基酸序列中 一些氨基酸残基的替换、插入或缺失所形成的氨基酸序列，只要这些氨基酸修饰过的蛋白 质或多肽具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性，能够转化果糖或山梨 糖生成D-阿洛酮糖或D-塔格糖。
[0037] 在本发明的方法中，能用于产生重组表达载体的表达载体可以是任何常规用于遗 传重组技术的表达载体，并且可以是，例如，pET-22b( + )。能够通过重组表达载体转化的微 生物可以是大肠杆菌(E. coli)BL21(DE3)。然而，所述微生物是不受限制的，只要它是任何 这样的微生物，即该微生物能够在经过包含所需要基因的重组表达载体转化后过表达该基 因，并且作为过表达的结果能够产生活性蛋白质或多肽。
[0038] 更详细地，以下培养转化的微生物和诱导本发明的蛋白质或多肽过表达的过程可 以根据本发明的示范的实验方案如以下描述进行。将低温保存的重组大肠杆菌接种到装有 50mL LB培养基的250mL的烧瓶中，并将该菌株在维持在37 °C的摇床中培养，直到600nm处 的吸光度达到2.0。将该培养溶液加入到装有5L发酵培养基的7L的发酵罐中，所述发酵培养 基由15g/L蛋白胨，25g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，2 g/L葡萄糖，3 g/L乳糖组成，并将该 混合物在所述发酵罐中培养，以诱导本发明的蛋白质的过表达。在发酵过程中，搅拌速率为 500rpm，通气量为1.0 vvm，及培养温度为37 °C，而且上述培养条件有利于大规模生产3-差 向异构酶。
[0039] 为了纯化由过表达所产生的蛋白质，将所述重组大肠杆菌培养溶液在6，000 X g，4°C离心30分钟，然后用0.85%的NaCl洗涤两次。随后，将该细胞重新悬浮于50 mM pH8.0 的磷酸钠缓冲溶液(含有300mM NaCl)中，并将含有所述细胞的缓冲溶液置于冰浴中30分 钟。利用高压均质机破碎该缓冲溶液中的细胞，将破碎的细胞在13，000 X g，4°C离心20分 钟，并将其除去，而使上清液通过孔径〇. 45um的滤膜进行过滤，并通过低温条件下的快速蛋 白质色谱法对其进行纯化。将含有本发明的蛋白质的滤出液加入HisTrap HP柱，所述 HisTrap HP柱是经过50 mM pH8.0的磷酸钠缓冲溶液平衡的，其中所述磷酸钠缓冲溶液含 有300mM NaCl和10 mM咪唑。随后，用相同的磷酸钠缓冲溶液洗涤该HisTrap HP柱，并且再 用含有浓度梯度为从10 mM到200mM的咪唑的相同磷酸钠缓冲溶液洗脱附着于该柱的蛋白 质，其流速为lmL /min。将含有本发明蛋白质的洗脱液加入到HiPrep 16/60树脂柱中去除 咪唑，所述HiPrep 16/60树脂柱是经过pH7. 5的50 mM的磷酸钠缓冲溶液平衡的，并且再以 6mL/min的速率洗脱该蛋白质。将由此所收集的蛋白质溶液加入到Sephacryl S-100 HR柱 中以洗脱该蛋白质，所述Sephacryl S-100HR柱是经过pH7.5的含有0.15M NaCl的50 mM的 磷酸钠缓冲溶液平衡的，其流速为6mL/min，最后将洗脱的白质在50 mM的磷酸钠缓冲溶液 中进行透析。
[0040] 如上述所获得的本发明的蛋白质是3-差向异构酶，所述3-差向异构酶的单体分子 量为31770 Da。该3-差向异构酶是金属酶，金属离子对其活性有明显促进。
[0041] 根据本发明的另一个实施方案，3-差向异构酶在金属离子的存在下反应，可实现提高 由果糖生产D-阿洛酮糖产量的目的，也可实现提高由山梨糖生产D-塔格糖产量的目的。所 述金属离子选自下列各项组成的组:锰、镁和钴，其浓度范围为0.5 - 5mM，例如，1 mM。当所 述金属离子的浓度低于0.5 mM时.提高转化率的作用并不明显，而当所述金属离子的浓度 高于5 mM时，转化率并没有显著的差异。
[0042] 该3-差向异构酶和果糖或山梨糖间的反应可利用浓度为10-75%(w/w)，pH6_8和 温度为50-90°C的底物（即果糖或山梨糖溶液)进行。当该底物，即果糖或山梨糖的浓度在 10-75%(w/w)的范围内时，D-阿洛酮糖或D-塔格糖的产量好，转化率高，且上述范围的pH和 温度条件是对3-差向异构酶活性最佳的pH和温度范围。
[0043]该3-差向异构酶具有优良的热稳定性，在60°C保温12小时后活性仍没有检测到活 性下降，在80°C保温12小时后，活性仍然保持在80%以上，在90 °C保温8小时后仍然有50%的 残余活性。该3-差相异构酶优良的热稳定性对较高温度条件下生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖 而言是优良的性能。
[0044]根据本发明另一个实施方案，该3-差向异构酶转化果糖生产D-阿洛酮糖和转化山 梨糖生产D-塔格糖的反应可通过在反应过程中将3-差向异构酶固定在载体上进行，这是因 为固定在载体上的3-差向异构酶能够长期地保持酶活性且便于重复使用。用于本发明目前 的实施方案中的载体可以是任意己知其在酶固定化中用途的载体，并且可以是例如，海藻 酸钠。海藻酸钠是天然胶体多糖，它在藻类细胞壁中很丰富，且含了0-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸残基，所述0-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸残基通过0-1，4键随机连接。因 此，海藻酸钠容许3-差向异构酶稳定的固定，且有利于获得较高的D-阿洛酮糖或D-塔格糖 产量。为了获得D-阿洛酮糖或D-塔格糖的最大产量，海藻酸钠可用于进行3-差向异构酶的 固定，其浓度为1.5-4%(w/v)，例如浓度为2.5%(w/v)。当海藻酸钠用作固定3-差向异构酶的 载体时，将所述3-差向异构酶的溶液加入到海藻酸钠水性溶液中，所述海藻酸钠水性溶液 的体积是3-差向异构酶溶液体积的一倍或两倍，然后利用注射器栗和真空栗将该混合物逐 滴地加入到0.2M钙离子溶液中，从而形成3-差向异构酶-海藻酸钠复合体球。这些3-差向异 构酶-海藻酸复合体球可接用于转化果糖生产D-阿洛酮糖以及转化山梨糖生产D-塔格糖的 反应中。
[0045] 本发明的3-差向异构酶对果糖和山梨糖均具有良好的活性和优良的热稳定性，这 两点对较高温度条件下生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是优良的性能。根据本发明实施方 案的生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法是对环境友好的，这是因为使用了源自微生物的 酶，并且该方法要求简单的酶固定化过程，以及显著地增加了 D-阿洛酮糖和D-塔格糖的生 产产量和生产效率，因此降低了生产成本，而最大化了生产的效果。
[0046] 由此生产的D-阿洛酮糖和D-塔格糖能够有效地用作食品或药物的添加剂。
[0047] 有利作用 本发明的3-差向异构酶对果糖和山梨糖均具有良好的活性和优良的热稳定性，这两点 对高温度条件下生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是优良的性能。根据本发明实施方案的生 产D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法是对环境友好的，这是因为使用了源自微生物的酶，并且 该方法要求简单的酶固定化过程，以及显著地增加了 D-阿洛酮糖和D-塔格糖的生产产量和 生产效率，因此降低了生产成本，而最大化了生产的效果。
[0048] 由此生产的D-阿洛酮糖和D-塔格糖能够有效地用作食品或药物的添加剂。
【附图说明】
[0049] 图1是本发明实施例1中3-差向异构酶的生产流程图； 图2-1是本发明实施例5中pH对于3-差向异构酶活性影响的曲线图； 图2-2是本发明实施例5中温度对于3-差向异构酶活性影响的曲线图； 图3是本发明实施例6中温度活性关系图； 图4是本发明实施例7中利用3-差向异构酶所转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率示意 图； 图5是本发明实施例11中利用3-差向异构酶所转化山梨糖生产D-塔格糖的转化率示意 图。
【具体实施方式】
[0050] 下文中，将参考具体实施例对本发明进行更详细地描述。这些实施例仅仅是为了 例证的目的，而非意欲限制本发明的范围。
[0051] 在目前的试验实施例中，利用果糖和山梨糖作为底物测量了其酶活性。为了测量 其酶活性，将3-差向异构酶与含有10%果糖或山梨糖的50mM pH7.5磷酸钠缓冲溶液混合，在 60 °C条件下反应20分钟，再在100°C加热该反应溶液15分钟，以终止该反应。所述含有果糖 或山梨糖的磷酸钠缓冲溶液是通过将果糖或山梨糖溶解于PH7-8的磷酸钠缓冲溶液中，以 达到浓度60-70%(w/v)配制而成的，并且将该含有果糖或山梨糖的磷酸钠缓冲溶液持续地 加入到维持在60°C的生物反应器中。为了实现方便比较其酶活性的目的，将一单位的阿洛 酮糖-3-差向异构酶定义为在pH7.5和60 °C条件下每分钟生产1摩尔D-阿洛酮糖所需要的 阿洛酮糖-3-差向异构酶的量;将一单位的塔格糖-3-差向异构酶定义为在pH7.5和60 °C条 件下每分钟生产1摩尔D-塔格糖所需要的塔格糖-3-差向异构酶的量。果糖、D-阿洛酮糖、山 梨糖、D-塔格糖的浓度是利用高效液相色谱法测量的，该高效液相色谱法使用BP-100钙离 子碳氢化合物柱和RI检测器，柱温80°C，流动相为超纯水，流速0.5 mL/min。
[0052] 实施例1:3-差向异构酶的生产 差向异构酶基因是通过合成Thermogemmatispora carboxidivorans中标注为差向 异构酶的多肽的基因获得的，所述差向异构酶基因是仅根据序列，而不是根据其功能方面 的表征结果所定义的。通过利用限制性内切酶Ndel和Xhol，将获得的差向异构酶基因插入 到表达载体pET-22b( + )中，从而产生重组表达载体pET-22b( + )/差向异构酶(见图1)。通过 常规转化方法，将该重组达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化得到的重组大肠杆菌 BL21 (DE3)保藏在-80°C的超低温冰箱中。
[0053]此后，将该重组大肠杆菌接种在装有50mL液体LB培养基的250mL三角烧瓶中，并在 37 °C的摇床中培养活化，直到培养液在波长600nm处的吸光度达到2.0。将该培养液加入 到装有5L发酵培养基的7L的发酵罐中，进行发酵培养以大规模生产3-差向异构酶。在发酵 过程中，维持搅拌速率为500rpm，通风率为1.0 vvm，培养温度为37°C。
[0054] 实施例2:3-差向异构酶的纯化 为了对3-差向异构酶的性质进行表征，利用亲合色谱法(HisTrap HP柱），HiPrep 16/ 60柱和S印hacryl S-100 HR柱纯化3-差向异构酶。
[0055] 测量了该纯化的3-差向异构酶的分子量，发现该3-差向异构酶单体分子量为 31770Da的。证实了该3-差向异构酶的氨基酸序列与NCBI登记号WP_052889376的氨基酸序 列相同。
[0056] 实施例3:3-差向异构酶的金属依赖性 在实施例3中，为了研究金属离子的对该3-差向异构酶的影响，在不同金属离子存在条 件下将果糖作为底物测定对其活性的影响，测量是在用EDTA处理该3-差向异构酶后，向3-差向异构酶溶液中加入1 mM下表1中所示的各种金属离子后进行的。该3-差向异构酶反应 在50 mMpH7.5的Tri s缓冲溶液中，60 °C条件下进行20分钟，其中所述Tr i s缓冲溶液含有 0.04 U/mL的3-差向异构酶和10%(w/v)的果糖，再将该反应溶液在100 °C加热15分钟，以终 止该反应，然后测量该3-差向异构酶的活性。
[0057] 结果显示该3-差向异构酶具有金属依赖性，如下表1所示，镁、锰和钴离子增强其 酶活性，而铜和锌离子抑制其酶活性。
实施例4:3-差向异构酶的底物特异性 该3-差向异构酶反应在50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，pH7.5和60 °C条件下进行20分 钟，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有〇.〇4U/ml的该3-差向异构酶和10 mM下表2中所示的各种 单独的单糖，再将每个反应溶液在100 °C加热15分钟，以终止该反应，然后，测量了每种反 应溶液中该3-差向异构酶的酶活性。
[0059]结果显示该3-差向异构酶对D-果糖、D-阿洛酮糖、D-山梨糖、D-塔格糖均具有活 性，该3-差向异构酶除可用于生产D-阿洛酮糖，也可用于生产D-塔格糖。
实施例5: pH和温度和对3-差向异构酶活性的影响 在实施例5中，为了研究不同pH和温度对该3-差向异构酶活性的影响，在不同的温度和 pH条件下将果糖作为底物测定对其活性的影响，且比较了在不同温度和pH下的酶活性。为 了研究pH的作用，该3-差向异构酶的反应在pH范围6.0-8.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中进 行，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有〇. 〇4U/mL的该3-差向异构酶和10%(w/v)的果糖。在此，各 自的反应在60°C、无金属离子加入的条件下进行20分钟，然后在100 °C加热15分钟来终止 该反应，并测量了其酶活性。其结果在图2-1中所说明。
[0061 ]为了研究温度的作用，该反应在50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，温度范围40-90°C中 进行了20分钟，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有0.04 U/mL的该3-差向异构酶和10%(w/v)的 果糖，在PH7.5条件下进行反应。通过在100 °C加热15分钟来终止该反应，并测量了其酶活 性。其结果在图2-2中所说明。
[0062] 结果显示该3-差向异构酶的最佳pH和温度分别为7.5和90°C。
[0063]图2-1是显示在本发明实施方案条件下pH对于3-差向异构酶活性影响的曲线图。 [0064]图2-2是显示在本发明实施方案条件下温度对于3-差向异构酶活性影响的曲线 图。
[0065] 实施例6:3-差向异构酶的热稳定性 在实施例6中，为了研究该3-差向异构酶的热稳定性，将该3-差向异构酶分别置于不同 温度条件下保温，在不同时间取样将果糖作为底物测定其残余活性。测量是在将该3-差向 异构酶分别置于50°(：、60°(：、70°(：、80°(：和90°(：水浴条件下保温后，每隔1小时取样进行的。 该3-差向异构酶反应在50 mMpH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，60 °C条件下进行20分钟，其中所 述磷酸钠缓冲溶液含有0.04 U/mL的3-差向异构酶和10%(w/v)的果糖，再将该反应溶液在 100°C加热15分钟，以终止该反应，然后测量该3-差向异构酶的活性。其结果在图3中所说 明。
[0066]结果显示该3-差向异构酶具有优良的热稳定性，在60°C保温12小时后活性仍没有 检测到活性下降，在80°C保温12小时后，活性仍然保持在80%以上，在90°C保温8小时后仍然 有50%的残余活性。
[0067] 实施例7:利用3-差向异构酶所转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率 在实施例7中，该3-差向异构酶的反应在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，温度范围 40-90°C条件下进行12小时，从而容许该反应充分地进行，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有该 3_差向异构酶0.04 U/mL，1 mM的钴离子，和10%(w/v)的果糖。然后，通过在100°C加热15分 钟来终止该反应，并测量样品中果糖和D-阿洛酮糖的含量。其结果在图4中所说明。
[0068]结果显示在12小时后该3-差向异构酶转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率在90°C 时转化率最高，为39%，50 °C时转化率最低，为22%，而在60 °C时转化率为37%。
[0069] 实施例8:利用3-差向异构酶生产D-阿洛酮糖 为了生产高浓度的D-阿洛酮糖，该反应在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，60 °C条 件下进行反应，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有10 U/mL的该3-差向异构酶，1 mM的钴离子和 700g/L的果糖。然后在不同反应时间点取样，通过在100 °C加热15分钟终止该反应，并测量 样品中D-阿洛酮糖的浓度。不同反应时间的D-阿洛酮糖产量显示在下表3中。
结果显示，反应6小时，产生了259 g/L的D-阿洛酮糖，转化率约为37%。
[0071] 实施例9:通过固定化酶生产D-阿洛酮糖 为了研究该生产D-阿洛酮糖方法的效率，对该3-差向异构酶进行了固定化。测量了固 定化的3-差向异构酶生产产量，将其与未固定的(游离的）3_差向异构酶的生产产量进行比 较。
[0072]对于固定在载体上的3-差向异构酶，使用了 3-差向异构酶-海藻酸钠复合体球，该 小球是通过如下方法制备的：将3-差向异构酶溶液加入到2.5% (w/v)的海藻酸钠溶液中， 所述海藻酸钠溶液的体积是所述3-差向异构酶溶液体积的1.5倍，再利用注射器栗和真空 栗将该混合物加入到0.2M|丐离子溶液中。
[0073]除了使用了固定的3-差向异构酶之外，该反应以与实施例7中相同的方式进行。该 反应中所用的3-差向异构酶的量为10 U/mL，并测量了D-阿洛酮糖生产率。其结果显示在下 表4中。
结果显示，固定化的3-差向异构酶在反应8小时后达到最大产量258 g/ L，转化率约为 37%，比游离的3-差向异构酶反应速度稍慢，但是固定化的3-差向异构酶更利于连续化生 产，实现D-阿洛酮糖的高效生产。
[0075] 实施例10:D-阿洛酮糖在生物反应器中的生产产量 以下反应在生物反应器中进行，从而检验实施例9的固定化的3-差向异构酶生产产量。
[0076] 首先，该固定化的3-差向异构酶和果糖以与实施例9中相同的方式制备，将果糖加 入到该固定化的3 -差向异构酶中，并将该混合物调节为体积100mL随后，将高100cm和直径 2.6cm的生物反应器中充满所述固定化的3-差向异构酶和果糖的混合物，且该反应在流速 10 mL/h和60 °C条件下进行。所用的3-差向异构酶的量为500U，且所用果糖的浓度限制为 600g/L，这归因于长时间操作过程中过量果糖的沉淀问题。其结果显示在下表5中。
结果显示，3-差向异构酶和果糖间的反应在整个30天的试验周期中是稳定的，从果糖 向D-阿洛酮糖的转化率为37%，产物D-阿洛酮糖浓度为220 g/L。其产量能够满足糖类大规 模生产的需要。
[0078] 因此，本发明能够提供利用生物反应器的D-阿洛酮糖生产系统，所述生物反应器 能够进行工业规模的大规模生产。
[0079] 实施例11:利用3-差向异构酶所转化山梨糖生产D-塔格糖的转化率 在实施例11中，该3-差向异构酶的反应在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，温度范围 40-90°C条件下进行12小时，从而容许该反应充分地进行，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有该 3_差向异构酶0.04 U/mL，1 mM的钴离子，和10%的山梨糖。然后，通过在100 °C加热15分钟来 终止该反应，并测量样品中山梨糖和D-塔格糖的含量。其结果在图5中所说明。
[0080] 结果显示在12小时后该3-差向异构酶转化山梨糖生产D-塔格糖的转化率在90 °C 时转化率最高，为36%，50 °C时转化率最低，为29%，而在60 °C时转化率为34%。
[0081 ]实施例12:利用3-差向异构酶生产D-塔格糖 为了生产高浓度的D-塔格糖，该反应在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，60 °C条件 下进行反应，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有20 U/mL的该3-差向异构酶，1 mM的钴离子和 500g/L的山梨糖。然后在不同反应时间点取样，通过在100 °C加热15分钟终止该反应，并测 量样品中D-塔格糖的浓度。不同反应时间的D-塔格糖产量显示在下表6中。
结果显示，反应8小时，产生了 171 g/L的D-塔格糖，转化率约为34%。
[0083] 实施例13:通过固定化酶生产D-塔格糖 为了研究该生产D-塔格糖方法的效率，对该3-差向异构酶进行了固定化。测量了固3定 化的3-差向异构酶生产产量，将其与未固定的（游离的）3_差向异构酶的生产产量进行比 较。
[0084]对于固定在载体上的3-差向异构酶，使用了 3-差向异构酶-海藻酸钠复合体球，该 小球是通过如下方法制备的：将3-差向异构酶溶液加入到2.5% (w/v)的海藻酸钠溶液中， 所述海藻酸钠溶液的体积是所述3-差向异构酶溶液体积的1.5倍，再利用注射器栗和真空 栗将该混合物加入到0.2M钙离子溶液中。
[0085]除了使用了固定的3-差向异构酶之外，该反应以与实施例12中相同的方式进行。 该反应中所用的3-差向异构酶的量为20 U/mL，并测量了D-塔格糖生产率。其结果显示在下 表7中。
结果显示，固定化的3-差向异构酶在反应10小时后达到最大产量170g/ L，转化率约为 34%，与游离的3-差向异构酶相比反应速度稍慢，但是固定化的3-差向异构酶更利于连续化 生产，实现D-塔格糖的高效生产。
[0087] 实施例14:D_塔格糖在生物反应器中的生产产量 以下反应在生物反应器中进行，从而检验实施例13的固定化的3-差向异构酶生产产 量。
[0088] 首先，该固定化的3-差向异构酶和山梨糖以与实施例13中相同的方式制备，将山 梨糖加入到该固定化的3 -差向异构酶中，并将该混合物调节为体积10 0 m L随后，将高10 0 cm和直径2.6 cm的生物反应器中充满所述固定化的3-差向异构酶和山梨糖的混合物，且该 反应在流速10 mL/h和60 °C条件下进行。所用的3-差向异构酶的量为400 U，且所用山梨糖 的浓度为400 g/L。其结果显示在下表8中。
结果显示，3-差向异构酶和山梨糖间的反应在整个30天的试验周期中是稳定的，从山 梨糖向D-塔格糖的转化率为34%，产物D-塔格糖浓度为170 g/L。其产量能够满足糖类大规 模生产的需要。
[0090]因此，本发明能够提供利用生物反应器的D-塔格糖生产系统，所述生物反应器能 够进行工业规模的大规模生产。
【主权项】
1. 一种新型3-差向异构酶，其选自下组： (a) 多肽或蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID No: 2具有至少70%，例如至少75%，至少80%， 至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%，至少99%，或甚至100%序列同一性； (b) 多肽或蛋白质，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂 交：（i)SEQ ID N〇:l的多肽编码序列，（ii)包含SEQ ID N〇:l的多肽编码序列的基因组DNA 序列，或（iii) (i)或（ii)的全长互补链； (c) 多肽或蛋白质，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO: 1的多肽编码序列 具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性； (d) SEQ ID N0:2的多肽或蛋白质包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插 入的变体； (e) 任何(a)、（b)或（c)的多肽或蛋白质，其氨基酸序列包含SEQ ID N〇:2或由SEQ ID No :2组成，和 (〇(&)，（13)，（〇)，（(1)，或(6)的多肽或蛋白质的片段，其具有3-差向异构酶活性。2. 权利要求1的分离的多肽或蛋白质，其与SEQ ID No:2的多肽或蛋白质的氨基酸序列 具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性。3. 权利要求1或2任一项的分离的多肽或蛋白质，其包含SEQ ID N〇:2或由SEQID N〇:2 组成。4. 一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项的多肽或蛋白质。5. -种核酸构建体或表达载体，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地 连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质在表达载体中的 产生。6. -种重组宿主细胞，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一 个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽或蛋白质的产生。7. -种产生权利要求1至3任一项的多肽或蛋白质的方法，其包括： (a) 在有助于所述多肽或蛋白质的产生的条件下培养细胞，其以其野生型形式产生所 述多肽或蛋白质； 和 (b) 回收所述多肽或蛋白质。8. -种产生权利要求1至3任一项的多肽或蛋白质的方法，其包括： (a) 在有助于所述多肽或蛋白质的产生的条件下培养权利要求6的宿主细胞;和 (b) 回收所述多肽或蛋白质。9. 一种组合物，其包含权利要求1至3任一项的多肽或蛋白质和其它酶。10. 权利要求1至3任一项的多肽或蛋白质或权利要求9的组合物在用于生产D-阿洛酮 糖的工艺中的用途。11. 权利要求1至3任一项的多肽或蛋白质或权利要求9的组合物在用于生产D-塔格糖 的工艺中的用途。12. -种用于生产D-阿洛酮糖的方法，其包括将果糖、葡萄糖及淀粉糖等混合糖与权利 要求1至3任一项的多肽或蛋白质的水性溶液相接触生产D-阿洛酮糖。13. -种用于生产D-塔格糖的方法，其包括将山梨糖及淀粉糖等混合糖与权利要求1 至3任一项的多肽或蛋白质的水性溶液相接触生产D-塔格糖。14. 权利要求12至13任一项的方法，其中所述多肽或蛋白质是权利要求1至3任一项所 述的多肽或蛋白质。
【文档编号】C12P19/24GK105821027SQ201610047300
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】魏淼, 严明, 章志林, 陈圣
【申请人】南京朗奈生物技术有限公司