一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸制备技术领域，尤其涉及一种烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸的制备方法。
【背景技术】
[0002] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(缩写为NAD)，也称为二磷酸吡啶核苷酸（缩写为DPN)，或 辅脱氢酶I或辅酶I。在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型（NADH)两种状态，氧化型 (NAD+)在260nm处具有最大紫外吸收光谱，通过各种脱氨酶，从底物中接受一个氢原子和一 个电子，变成还原型(NADH)，在340nm处有最大吸收。
[0003] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活 动，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定， 维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程 度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。
[0004] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸主要存在于酵母细胞线粒体中，目前通常选用破壁和提纯 的方法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，常用的破壁方法有温差法(热处理法)和高压均浆法， 温差法破壁效果不理想，高压均浆法不适合工业化大生产，常用的提纯方法为柱洗脱，但是 柱洗脱过程繁琐，耗时长，不利于工业化生产，溶剂使用量大，污染环境，制得的烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸纯度低，收率低。因此需要提供一种新的制备方法。
【发明内容】
[0005] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明提出了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备 方法，本发明操作简便，设备简单，适合工业化生产，大大缩短了制备时间，使用溶剂种类 少、使用量少，使用的原料廉价易得，制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高，收率好。
[0006] 本发明提出的一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0007] S1、破碎细胞：将酵母细胞加入盐酸水溶液中浸泡0.5-2.5h，进行温差破壁处理 后，用陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A;
[0008] S2、浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调 节浓缩液B的pH=2-2.5得到浓缩液C;
[0009] S3、洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用氨水洗脱，收集洗脱液D，用盐酸 水溶液调节洗脱液D的pH=7-8后，过717树脂柱，用氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E; [001 0] S4、分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的 pH= 1-3，加丙酮沉淀，离心得到固体G;
[0011] S5、纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩， 冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
[0012] 优选地，S1中，盐酸水溶液的质量分数为0.04-0.55wt %，酵母细胞和盐酸水溶液 的重量体积(g/ml)比为3-5:16-80。
[0013] 优选地，si中，陶瓷膜孔径为40-80nm〇
[0014] 优选地，S2中，超滤膜的截留分子量为4000-6000D。
[0015] 优选地，S2中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D。
[0016] 优选地，S3中，氨水的浓度为0.1-0.3mol/l。
[0017] 优选地，S3中，氨水洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读 数为200-570时停止洗脱。
[0018] 优选地，S3中，氯化钾水溶液的浓度为0.1-0.3mol/l。
[0019] 优选地，S3中，氯化钾水溶液洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白 检测仪读数为< 200时停止洗脱。
[0020] 优选地，S4中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D。
[0021] 优选地，S4中，浓缩液F和丙酮的重量比为1:4-8。
[0022] 优选地，S5中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1 -2:5。
[0023]优选地，S5中，制备色谱的固定相为改性硅胶。
[0024] 优选地，S5中，脱盐时用质量分数为l-3wt%甲醇水溶液以20-30ml/mim的速度洗 涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为1 -2:55-80。
[0025] 优选地，S5中，分离时用30-40min内，质量分数由3wt %匀速增至10wt %的甲醇水 溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为20_30ml/min，2-4g的固体G所用洗脱时间为30-40min。 [0026] 上述水均为去离子水。
[0027]上述"过柱"是本专业常用术语，是分离物质的一种方法。
[0028] 上述丙酮和甲醇均可回收利用。
[0029]上述S2中，超滤是一种过滤方法。
[0030] 上述S2和S3中，盐酸水溶液的作用是调节pH，不规定其质量分数，根据具体操作确 定其质量分数。
[0031] 上述S2和S4中，纳滤是一种过滤方法。
[0032]上述S3中，D152树脂为大孔弱酸阳离子树脂，717树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交 换树脂。
[0033]上述S4中，硝酸水溶液的作用是调节pH，不规定其质量分数，根据具体操作确定其 质量分数。
[0034]本发明选用盐酸浸泡酵母细胞后，再进行温差破壁，可以使酵母细胞壁更容易破 碎，促进更多的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶出；用陶瓷膜过滤去除菌体蛋白，超滤去除大分子 的蛋白质和杂质，纳滤去除无机盐和水，再经柱洗脱提纯，与常用的柱洗脱方法相比，大大 缩短了柱洗脱的工序，大大节省了时间，操作简便，适合工业化生产，且可避免其他杂质的 干扰，大大增加了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的纯度和收率;综合液E纳滤得到浓缩液F后，再经 丙酮沉淀，可大大减少丙酮的用量，减少环境污染，并可增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的收 率;固体G经过制备色谱的脱盐、分离，可以大大增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的纯度;制备色 谱用的有机溶剂为甲醇，甲醇和丙酮均匀廉价易得可降低本发明的成本，且溶剂用量少，回 收利用，可减少环境污染。
【具体实施方式】
[0035] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0036] 实施例1
[0037] -种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0038] S1、破碎细胞:将酵母细胞加入质量分数为0.04wt %盐酸水溶液中浸泡2.5h，进行 温差破壁处理后，用孔径为40nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水 溶液的重量体积(g/ml)比为5:16;
[0039] S2、浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调 节浓缩液B的pH=2.5得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为4000D，纳滤膜为聚醚砜 膜，纳滤膜的截留分子量为300D;
[0040] S3、洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0. lmol/1的氨水洗脱，收 集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为570时停止洗脱，用盐 酸水溶液调节洗脱液D的pH = 7后，过717树脂柱，用浓度为0.3mol/l的氯化钾水溶液洗脱， 收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为< 200时停止 洗脱；
[0041 ] S4、分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的 pH=l，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为 300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1:4;
[0042] S5、纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分 离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ ml)比为2:5，脱盐时用质量分数为lwt%甲醇水溶液以30ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、 甲醇水溶液的重量体积（g/ml)比为1:80,分离时用30min内，质量分数由3wt%勾速增至 10wt%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为30ml/min，2g的固体G所用洗脱时间为 30min〇
[0043] 实施例2
[0044] -种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0045] S1、破碎细胞:将酵母细胞加入质量分数为0.55wt %盐酸水溶液中浸泡0.5h，进行 温差破壁处理后，用孔径为80nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水 溶液的重量体积(g/ml)比为3:80;
[0046] S2、浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调 节浓缩液B的pH= 2得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为6000D，纳滤膜为聚醚砜膜， 纳滤膜的截留分子量为200D;
[0047] S3、洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.3mol/l的氨水洗脱，收 集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为200时停止洗脱，用盐 酸水溶液调节洗脱液D的pH = 8后，过717树脂柱，用浓度为0. lmol/1的氯化钾水溶液洗脱， 收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为< 200时停止 洗脱；
[0048] S4、分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的 pH=3,加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为 200D，浓缩液F和丙酮的重量比为1:8;
[0049] S5、纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分 离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ ml)比为1:5，脱盐时用质量分数为3wt%甲醇水溶液以20ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、 甲醇水溶液的重量体积（g/ml)比为2 : 55，分离时用40min内，质量分数由3wt %匀速增至 10wt%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为20ml/min，4g的固体G所用洗脱时间为 40min〇
[0050] 实施例3
[0051 ] -种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0052] S1、破碎细胞:将酵母细胞加入质量分数为0 . lwt %盐酸水溶液中浸泡2h，进行温 差破壁处理后，用孔径为5