0nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶 液的重量体积(g/ml)比为9:80;
[0053] S2、浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调 节浓缩液B的pH=2.4得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为4500D，纳滤膜为聚醚砜 膜，纳滤膜的截留分子量为300D;
[0054] S3、洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.15mo 1 /1的氨水洗脱， 收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为500时停止洗脱，用 盐酸水溶液调节洗脱液D的pH = 7.3后，过717树脂柱，用浓度为0.25mol/l的氯化钾水溶液 洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为< 200时 停止洗脱；
[0055] S4、分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的 pH=l. 5,加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为 300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1:5;
[0056] S5、纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分 离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ ml)比为1.8:5，脱盐时用质量分数为1.5wt %甲醇水溶液以27ml/mim的速度洗涤，其中，固 体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为3:175，分离时用32min内，质量分数由3wt %匀速增 至10wt%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为27ml/min，2.5g的固体G所用洗脱时间 为32min。
[0057] 实施例4
[0058] 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0059] S1、破碎细胞:将酵母细胞加入质量分数为0.4wt %盐酸水溶液中浸泡lh，进行温 差破壁处理后，用孔径为70nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶 液的重量体积(g/ml)比为7:120;
[0060] S2、浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调 节浓缩液B的pH=2.2得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为5500D，纳滤膜为聚醚砜 膜，纳滤膜的截留分子量为200D;
[0061 ] S3、洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.25mol/l的氨水洗脱， 收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为300时停止洗脱，用 盐酸水溶液调节洗脱液D的pH = 7.7后，过717树脂柱，用浓度为0.15mol/l的氯化钾水溶液 洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为< 200时 停止洗脱；
[0062] S4、分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的 pH = 2.5,加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为 200D，浓缩液F和丙酮的重量比为1:7;
[0063] S5、纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分 离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ ml)比为1.2:5，脱盐时用质量分数为2.5wt %甲醇水溶液以23ml/mim的速度洗涤，其中，固 体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为3:100，分离时用38min内，质量分数由3wt %匀速增 至10wt%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为23ml/min，3.5g的固体G所用洗脱时间 为38min〇
[0064] 实施例5
[0065] -种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0066] S1、破碎细胞:将酵母细胞加入质量分数为0.3wt %盐酸水溶液中浸泡1.5h，进行 温差破壁处理后，用孔径为70nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水 溶液的重量体积(g/ml)比为2:25;
[0067] S2、浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调 节浓缩液B的pH=2.3得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为5000D，纳滤膜为聚醚砜 膜，纳滤膜的截留分子量为300D;
[0068] S3、洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.2mol/l的氨水洗脱，收 集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为350时停止洗脱，用盐 酸水溶液调节洗脱液D的pH = 7.5后，过717树脂柱，用浓度为0.2mol/l的氯化钾水溶液洗 脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为< 200时停 止洗脱；
[0069] S4、分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的 pH=2,加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为 300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1:6;
[0070] S5、纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分 离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ ml)比为3:10，脱盐时用质量分数为2wt %甲醇水溶液以25ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、 甲醇水溶液的重量体积（g/ml)比为3:130，分离时用35min内，质量分数由3wt %匀速增至 1 Owt %的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为25ml/min，3g的固体G所用洗脱时间为 35min〇
[0071] 试验例1
[0072] 测定实施例1-5制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的纯度和收率，并与温差法-柱 洗脱方法制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作比较，结果如下表：
[0073]
[0074]其中，收率（％ )=烟酰胺腺嘌呤二核苷酸重/酵母细胞重X 100%
[0075]由上表可知，本发明的收率好，制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高。
[0076]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 破碎细胞:将酵母细胞加入盐酸水溶液中浸泡0.5-2.5h，进行温差破壁处理后，用 陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A; 52、 浓缩:取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓 缩液B的pH=2-2.5得到浓缩液C; 53、 洗脱:将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用氨水洗脱，收集洗脱液D，用盐酸水溶 液调节洗脱液D的pH=7-8后，过717树脂柱，用氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E; 54、 分离:将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F;用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH= 1 -3，加丙酮沉淀，离心得到固体G; 55、 纯化:将S4中得到固体G加水溶解，过制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干 得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。2. 根据权利要求1所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S1中，盐酸水 溶液的质量分数为〇. 04-0.55wt%，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为3-5:16-80 〇3. 根据权利要求1或2所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S1中，陶瓷 膜孔径为40_80nm。4. 根据权利要求1-3任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S2 中，超滤膜的截留分子量为4000-6000D;优选地，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量 为200-300D。5. 根据权利要求1-4任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S3 中，氨水的浓度为0.1-0.3mol/l;优选地，氨水洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核 酸蛋白检测仪读数为200-570时停止洗脱;优选地，氯化钾水溶液的浓度为0.1-0.3mol/l; 优选地，氯化钾水溶液洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为< 200时停止洗脱。6. 根据权利要求1-5任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S4 中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D;优选地，浓缩液F和丙酮的重量比 为1:4-8〇7. 根据权利要求1-6任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5 中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1 -2:5。8. 根据权利要求1-7任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5 中，制备色谱的固定相为改性硅胶。9. 根据权利要求1-8任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5 中，脱盐时用质量分数为1 _3wt%甲醇水溶液以20-30ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇 水溶液的重量体积(g/ml)比为1 -2:55-80。10. 根据权利要求1-9任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5 中，分离时用30_40min内，质量分数由3wt%匀速增至10wt%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中， 洗脱速度为20-30ml/min，2-4g的固体G所用洗脱时间为30-40min。
【专利摘要】本发明公开了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：S1、破碎细胞；S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2-2.5得到浓缩液C；S3、洗脱；S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1-3，加丙酮沉淀，离心得到固体G；S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高，收率好。
【IPC分类】C07H19/207, C07H1/08
【公开号】CN105481923
【申请号】CN201511022464
【发明人】王康林, 金永红, 杨杨, 汪祥
【申请人】平光制药股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日