一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用
【专利摘要】本发明公开了一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的基因开放读码框全长1068bp，编码355个氨基酸。具有SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，利用此序列信息，克隆该基因，构建MsFLS基因的克隆载体以及植物表达载体，并将该基因以农杆菌介导法转入模式植物烟草中，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能力，说明MsFLS基因的过表达提高了植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsFLS基因为研究苜蓿抗逆分子机理及育种提供了理论依据。
【专利说明】
-种紫花首着抗盐碱基因 MsFLS及其编码蛋白与应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体设及一种紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S及 其编码蛋白与应用。
【背景技术】
[0002] 黄酬类物质是植物次生代谢产物中的一个庞大家族。在植物中，黄酬类化合物广 泛参与各种生物学过程，包括对病原体的响应、授粉、光通路、种子发育等。另外，许多黄酬 类化合物的生物合成受到环境胁迫的诱导，因此，在植物受到生物或非生物胁迫时，黄酬类 物质的表达水平会显著增加，例如病原体，营养缺乏，盐碱胁迫等。运些环境胁迫因素的共 同特点是，他们都会产生和积累次生活性氧，如超氧阴离子(〇2)、过氧化氨化2〇2)、径基自 由基(OH)和单线态氧(1化)等。而活性氧的积累会导致胞内产生氧化胁迫从而造成细胞组分 的损伤，例如核酸，脂质，蛋白和多糖等物质。植物细胞有一个复杂而完整的活性氧代谢系 统，包括酶促和非酶促调节机制。
[0003] 类黄酬物质中包括多种广为人知的抗氧化物质参与植物活性氧代谢，例如抗坏血 酸，O-生育酪等。体外实验中，黄酬类物质作为氨离子和电子供体参与细胞的抗氧化代谢 中，抵御氧化胁迫的损伤。黄酬醇合成酶(FLS)是类黄酬合成代谢中的关键酶之一，催化3- 径基黄酬生成黄酬醇，在盐碱胁迫条件下受诱导大幅上调，进而调控类黄酬物质在胁迫下 的响应。
[0004] ±壤盐碱化是影响农业生产重要因素之一，研究植物耐受机理和提高作物耐盐碱 性已经日渐成为广泛关注的问题。盐碱胁迫通常会引起植物细胞离子和渗透压的失衡，并 因此引发次级的胁迫伤害，例如活性氧积累而形成的氧化胁迫，盐碱胁迫伴随的高pH更是 可W直接对细胞质膜造成氧化损伤。长期W来，研究者利用形态学和生理学的研究方法已 经初步认识了植物应对盐碱胁迫的响应机制，并W基因克隆和遗传转化等技术分析上述过 程中部分关键基因的功能，基因忍片技术也用于研究盐碱胁迫下植株的转录组变化特征， 例如拟南芥，水稻等植物。尽管近年来已经鉴定了一系列逆境胁迫信号转导途径及相关基 因，但是目前对植物耐盐碱机制研究的资料仍然十分匿乏，完善的植物盐碱耐受机制尚未 建立，值得进行更加深入的研究。
[0005] 紫花首猜作为种植广泛的牧草，有"牧草之王"的美称，在世界范围内广泛种植，是 美国第=大作物，在我国也有大面积种植，是一种极具经济价值的豆科牧草。紫花首猜属于 中等耐盐碱植物，对盐碱胁迫具有一定的耐受能力，但盐碱胁迫仍是影响中国东北地区紫 花首猜产量的主要环境因素之一，严重限制了该地区紫花首猜的产量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种紫花首猜抗盐碱基因 MsFLS及其编码蛋白与应用。
[0007] 本发明是通过W下技术方案来实现：
[000引本发明公开了一种紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S，该抗盐碱基因 Ms化S的核巧酸序列 如沈Q. ID.NO. I所示。
[0009] 该抗盐碱基因 MsFLS全长为1068bp，编码355个氨基酸。
[0010] 本发明公开了由上述紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序 列如沈Q. ID.NO. 2所示。
[0011] 本发明公开了含有上述的紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S的表达载体，该表达载体为 植物表达载体pCBM-FLS。
[0012] 本发明还公开了上述的紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S在提高紫花首猜对环境盐碱胁 迫抗性中的应用。
[0013] 构建含有权利要求1所述紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S的植物表达载体，再将所构建 的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织中，筛选获得盐碱抗性增强的植物。
[0014] 本发明还公开了上述紫花首猜抗盐碱基因 Ms化S编码的蛋白在提高紫花首猜对环 境盐碱胁迫抗性中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0016] 本发明从紫花首猜中获得Ms化S基因的全长cDNA，该基因的核巧酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本发明克隆了紫 花首猜MsFLS基因，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得过表达MsFLS基因烟草，转基因烟草 在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的盐碱耐受能 力，说明Ms化S基因的过表达提高了转基因植株对盐碱的抗性，说明该基因能够参与植物的 抗逆过程。本发明中的Ms化S基因为研究首猜抗逆分子机理及育种提供理论依据。
【附图说明】
[0017]图1为Ms化S的核巧酸和氨基酸序列信息；
[0018] 图2为MsFLS与其他物种同源蛋白系统进化关系；
[0019] 图3为植物表达载体pCBM-FLS构建示意图
[0020] 图4为过表达MsFLS转基因烟草幼苗叶片PCR检测图；
[0021] 其中，V'为阳性对照，为阴性对照，0为空白对照，1-12为PCR获的目的条带，与 阳性一致，为转基因植株；
[0022] 图5为Ms化S转基因烟草L6与野生型烟草WT在30mmol L-I碳酸氨钢胁迫处理0天和7 天后的叶片表型；
[0023] 图6为Ms化S转基因烟草L6与野生型烟草WT在30mmol L-I碳酸氨钢胁迫处理0天和7 天后烟草叶片的叶绿素含量；
[0024] 图7为Ms化S转基因烟草L6与野生型烟草WT在30mmol L-I碳酸氨钢胁迫处理0天和7 天后烟草叶片MDA的含量；
[0025] 图8为Ms化S转基因烟草L16与野生型烟草WT在SOmmol L-I碳酸氨钢胁迫处理0天和 7天后进行的NBT染色。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0027] I、紫花首猜MsFLS基因的克隆
[00巧]从NCBI数据库中化ttp://www.ncbi.nlm.n化.gov/)捜索紫花首猜近源物种裝襲 首猜的核巧酸序列并保存，通过对紫花首猜盐碱胁迫下的转录组测序获得紫花首猜中受盐 碱胁迫诱导表达的化S基因，通过BLAST比对和进化树分析确定化S基因的核巧酸序列。利用 该序列设计克隆引物，引物为：
[00 巧]MsFLS-F:5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3';
[0030] MsFLS-R:5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3 \
[0031 ] 具体流程如下：
[0032] 1)RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取紫花首猜(Medicago sativa)全株RNA，经 RT-PCR反转录为CDNA，W该CDNA为模板进行Ms化S基因的克隆；
[0033] 2)RT-PCR反应：用反转录试剂盒化irst Strand cDNA Synthesis Kit,Toyobo)进 行RT-PCR反应，反应程序：37°C延伸15min;98°C变性5min。反转录植物全株RNA，获得单链 CDNA，W内参引物Act in为引物，W该CDNA为模板进行PCR评估CDNA质量无误，用W进行后续 实验；
[0034] 3)重组质粒转化到大肠杆菌DHSa(Toyobo)中，将插入的核巧酸序列利用CEQ8000 DNA Sequence;r(Beckman Coulter,California,USA)进行测序；
[0035] 4)最终拼接获取MsFLS基因 ORF的CDS全长序列。MsFLS基因 CDS全长为1068bp，编码 355个氨基酸。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与MtFLS (Medicago truncatula丄)相比，氨基酸同源性为97%，具备2个保守结构域，包括一个氨基端的铁离子 依赖的DIOX结构域和一个20G-FeII_0xy结构域，结果如图1所示。通过对其它物种中近源基 因的比对及进化树构建可见，紫花首猜化S基因与裝襲首猜，大豆，鹰嘴豆等植物中的同源 基因进化关系较近，与小麦等植物进化关系较远，结果参见图2。
[0036] 2、紫花首猜MsFLS基因植物表达载体构建
[0037] 1) W本发明中MsFLS的CDNA序列，设计引物如下：
[0038] MsFLS-F:5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3';
[0039] MsFLS-R:5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3 \
[0040] W紫花首猜CDNA为模板，扩增MsFLS基因序列。
[0041] 反应条件：
[0042]
[0043] PCR产物低溫保藏备用；
[0044] 2)用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN)，回收PCR产物，获得的PCR产物与T载体 pMD-lST进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞D册a,挑取转化阳性的克隆提取质粒 送交上海生工公司进行测序，经过测序获得正确序列的克隆用于后续实验；
[0045] 3)将pCBM质粒用PstI进行酶切，去憐酸化，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段， 同时用PstI进行酶切连接在T载体的FLS片段，并回收，将回收的FLS片段与pCBM载体片段连 接，然后后转化DH5a感受态细胞，获得重组克隆，结果酶切和PCR检测后将正确的克隆命名 为pCBM-FLS，载体图如图3所示。
[0046] 3、农杆菌介导法转化烟草
[0047] 1)烟草的培养
[004引野生性烟草SR-I种子40粒W75%的乙醇浸没3min后用灭菌蒸馈水反复冲洗6次， 然后W10%的次氯酸钢原液浸泡15min，再用灭菌蒸馈水清洗6次，将种子置于MS固体培养 基中。待种子萌发后，移至含有MS固体培养基的大瓶中继续培养，待其叶片足够大时进行侵 染。
[0049] 2)农杆菌菌液制备
[0化0] 挑取-80°C冻存的带有Ms化S重组表达载体的农杆菌甘油菌在YEB+50mg/L Rif+ 50mg/L Km巧Omg/L Str的固体培养基上活化菌株，并在28°C培养箱中倒置培养36-4化，将 活化得到的农杆菌单菌落接种于相同成分的YEB液体培养基中，28°C振荡培养约16-24h， 0D600 = 0.4-0.6。取出培养液按照1:10接种相同成分的YEB液体培养基中进行二次活化，当 00600 = 0.4-0.6时，将菌液倒入无菌的50ml的离屯、管，于4°C条件下，5000巧m离屯、IOmin，去 掉上清液，用MS培养液重悬菌体至0D600为0.4左右，用于转化。
[0051] 3)烟草的侵染
[0052] 在超净工作台内，将重悬的农杆菌菌液倒入无菌培养皿中，将培养的烟草SR-I叶 片切至0.8mm的方形，作于外植体置于菌液中浸泡8min，其间不断震荡。取出外植体置于无 菌滤纸上吸去附着菌液，叶背面朝上接种于诱导愈伤组织形成的培养基MSl (MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)，在25±2°C条件下暗培养48-7化。然后接种到MS2(MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA+l.lmg/L PPT巧OOmg/L Cef)培养基上进行筛选培养，每20d更换一次诱导培 养基。经过侵染的叶片长出新的幼芽时，放入到MS3(MS+1.3mg/L PPT+500mg/L Cef)培养基 中进行生根，W待后续分子鉴定。
[0053] 4)转基因烟草小量DNA的提取
[0化4] 称取植物样品0.1 g,液氮研磨，向管中加入70化1预热到65。(：的2 XCTAB Buffer缓 冲液，混匀，65°C水浴45min，每5min轻轻的颠倒混匀，之后将离屯、管取出置于冰上，冷却至 室溫，加入等体积的酪:氯仿:异戊醇摇匀，12000rpm离屯、IOmin，取上清，向管中加入与上清 等体积的氯仿-异戊醇（24:1)轻轻混匀，4°C，12000rpm离屯、IOmin，取上清，加 1/10体积 3mol/L醋酸钢和2倍体积预冷乙醇(或等体积异丙醇），轻轻摇匀至出现絮状沉淀，置-20°C 醇沉30min，之后离屯、15min，弃上清，加入50化1预冷的70 %乙醇冲洗，离屯、IOmin，弃上清， 空气干燥，加入去离子水溶解。
[0055] 4、转MsFLS基因的烟草转化体的获得W及转化体的PCR检测
[0化6] PCR鉴定:FLS内部基因引物如下 [0057 ] Pr imer 1:5 '-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3 '
[0化引 Primer 2:5'-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3'
[0化9]反应条件：
[006
[0061] 参见图4, W提取的阳性植株的DNA为模板，用Ms化S内部基因引物进行PCR扩增，琼 脂糖凝胶电泳结果显示编号16为PCR获得的目的条带，与阳性一致（即能扩增出大约500bp 的目标DNA条带），为转基因植株。其中，V'为阳性对照，为阴性对照（即W野生型植株基 因组DNA为模板的PCR检测结果），0为空白对照，M为Marker DL2000。
[0062] 5、转基因烟草植株功能的初步验证
[0063] 1)配制30mmol L-In址C〇3溶液。
[0064] 2)烟草叶绿素含量测定
[0065] 取野生型和转基因烟草相同状态的叶片，用7mm直径的打孔器打孔，用化肥化培养 液胁迫处理7天，观察叶片变化，记录并拍照。参见图5,在30mM盐碱胁迫处理下，野生型烟草 明显变黄，转基因株系维持绿色，表明转基因株系对盐胁迫的耐受性显著高于野生型，30mM 盐碱胁迫条件下转基因株系叶片丙二醒含量，NBT染色结果表明转基因型植株的叶片在胁 迫条件下生成的超氧阴离子显著低于野生型，W上实验结果表明Ms化S基因在烟草中的过 表达提升了烟草对盐的耐受能力。
[0066] 取上述胁迫处理7天的叶片，提取叶绿素，测定叶绿素含量，计算盐胁迫处理7天后 植株叶绿素含量的变化量。测叶绿素含量方法如下：
[0067] ① 0.1 g叶片放入预冷的研鉢中，加 Iml预冷80%丙酬，加入少量石英砂研磨
[0068] ②转移液体到大离屯、管中，用80%丙酬洗研鉢直至无色。
[0069] ③ 10000巧m，离屯、5min，4°C。
[0070] ④取上清(记取上清量）。
[0071 ] ⑤像沉淀中加入80 %丙酬，洗沉淀，再离屯、，直至沉淀无色(记取上清量）。
[0072] 注:取上清的离屯、管暗处理。
[0073] @样品测定:取31111上清液在645]11]1和663]11]1处测吸光值。80%丙酬调零。
[0074] ⑦结果计算：Ca= 12.72A663- 2.59A64 已
[0075] Cb = 22.88A645-4.67A663
[0076] Ca+b = 20.21A645+8.02A663
[0077] 叶绿素含量(mg ? g-I或mg ? dm-2) =CXV/AX 1000
[0078] 式中：C为叶绿素浓度(mg ? kl) ;V为提取液总体积(ml) ;A为取样鲜重(g)。
[0079] 转基因植株和野生型植株在30mM Na肥化胁迫下，叶绿素含量因胁迫下降，转基因 植株在胁迫7天条件下，叶绿素含量明显高于相同胁迫条件下野生型植株，如图6所示。
[0080] 3)转基因叶片MDA含量测定
[0081 ] 取上述胁迫处理7天的叶片，测定MDA含量。
[0082] ①植物叶片置于预冷研鉢中，加入=氯乙酸研磨，离屯、取上清。
[0083] ②4 °C 1000巧m离屯、IOmin，取上清，上清即酶液。
[0084] ③测定液:2ml酶液+2ml TBA;对照调零:2ml蒸馈水+2ml TBA。
[0085] ④10(TC20分钟，降至常溫。
[0086] ⑤4°C 5000巧m离屯、15min，取上清。现化32nm和450nm处OD值。
[0087] 计算公式如下：
[008引丙二醒含量(皿ol/g) = (6.45 XA532 -0.56 XA450) X ViAWX V2)
[0089] Vi:样品液体总体积(ml)
[0090] V2:测定时样品体积(ml)
[0091] W:样品鲜重(g)
[0092] 将生长状态相同的野生型烟草和Ms化S转基因烟草用含30mM化肥化的MS培养基 胁迫处理7天，巧憶丙二醒(MDA)的含量。结果如图7所示，转基因株系在胁迫下的MDA积累量 显著低于野生型烟草。
[0093] 4)胁迫下烟草叶片NBT染色
[0094] 取胁迫处理的转基因和野生型烟草叶片于小瓶中，加入NBT染液（Img/mL)直至浸 没样品，将处理过的野生型和转基因烟草叶片浸泡在染色液中，在室溫黑暗培养过夜。吸去 染色液，加入乙醇:甘油：乳酸(3:1:1)漂洗液，沸水浴10分钟，迅速冷却，换漂洗液，至去除 全部叶绿素。染色结果如图8所示。在30mM盐碱胁迫处理下，转基因植株的着色范围显著小 于野生型烟草。
[00M]综上所述，本发明公开了紫花首猜的Ms化S基因及其克隆方法和应用，该基因开放 读码框全长l〇68bp，编码355个氨基酸。利用此序列信息，克隆该基因，构建Ms化S基因的克 隆载体W及植物表达载体，并将该基因W农杆菌介导法转入模式植物烟草中，转基因烟草 在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能 力，说明Ms化S基因的过表达提高了植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的 抗逆过程。本发明中的Ms化S基因为进行植物抗逆分子育种提供了新的基因资源，为研究植 物抗逆分子机理奠定了基础。
【主权项】
1. 一种紫花苜蓿抗盐碱基因 MsFLS，其特征在于，该抗盐碱基因 MsFLS的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.1 所示。2. 如权利要求1所述的紫花苜蓿抗盐碱基因 MsFLS，其特征在于，该抗盐碱基因 MsFLS全 长为1068bp，编码355个氨基酸。3. 由权利要求1所述的紫花苜蓿抗盐碱基因 MsFLS编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。4. 含有权利要求1所述的紫花苜蓿抗盐碱基因 MsFLS的表达载体，其特征在于，该表达 载体为植物表达载体PCBM-FLS。5. 权利要求1所述的紫花苜蓿抗盐碱基因 MsFLS在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性 中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，构建含有权利要求1所述紫花苜蓿抗盐碱基 因 MsFLS的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织 中，筛选获得盐碱抗性增强的植物。7. 权利要求2所述的蛋白在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性中的应用。
【文档编号】C12N15/53GK105925589SQ201610414881
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】郭长虹, 安逸民, 杜秉昊, 张军, 张雪
【申请人】哈尔滨师范大学