一种紫花苜蓿耐盐基因MsCDPK及其编码蛋白与应用
【专利摘要】本发明公开了一种紫花苜蓿耐盐基因MsCDPK及其编码蛋白与应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公开的MsCDPK基因开放读码框全长1650bp，编码549个氨基酸，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用核苷酸序列信息，获得该基因，构建该基因的克隆载体以及植物表达载体，并通过农杆菌介导法将该基因转入模式植物烟草中，将转基因烟草培养在含盐成分的MS培养基上，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐能力，说明MsCDPK基因的表达提高了植株对盐的抗性，暗示了该基因能够参与植物的抗盐过程。本发明中的MsCDPK基因为研究苜蓿抗盐分子机制及育种提供理论依据。
【专利说明】
一种紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK及其编码蛋白与应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，涉及紫花苜蓿抗盐相关基因 Ms⑶PK的获得， 具体涉及一种紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK及其编码蛋白与应用。
【背景技术】
[0002] 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)作为我国乃至世界上的一种重要豆科牧草，因其 产量高、草质优良、营养丰富、适应性强、能够在轻度盐渍地上生长良好等诸多优点而被日 益重视。肇东苜蓿，属于四倍体紫花苜蓿，作为中国东北地区的当家草种被广泛种植，而东 北地区土壤盐渍化不利于作物的正常生长发育，严重制约了农牧业的发展。因此，发掘紫花 苜蓿中的耐盐基因，深入研究紫花苜蓿的抗盐机制，对于克服土壤盐渍化的自然条件导致 的育种问题，具有重要意义。
[0003] 目前利用植物基因工程技术进行的植物抗盐研究已取得诸多进展。研究表明，将 植物或其他生物中与抗盐相关的基因转入植物中，可以使转基因植物对盐的抗性得到显著 提尚。
[0004] CDPK(Ca2+_dependent，calmodulin independent protein kinase)是植物|丐信号 传导过程中关键的蛋白激酶，在逆境胁迫信号传导过程中起到重要作用。CDPKs广泛存在与 植物中，且在植物体内广泛分布于各个器官。其中，拟南芥中有34个CDPK家族成员，水稻中 有29个CDPK家族成员，小麦中有20个家族成员。CDPK家族各成员间的蛋白结构比较保守，含 有4个结构域:N端可变域(N-terminal variable domain)、丝氨酸/苏氨酸激酶域(protein kinase domain)、自抑制域(auto-inhibitory domain)和类|丐调素结合域（calmodulin- like domain)。⑶PKs是植物细胞钙信号转导的重要感受器，通过作用于多种多样的互作底 物，参与植物对干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫的适应。在分子水平上，⑶PKs通过磷酸化调节 不同的底物蛋白的活性，进而实现基因表达调控、离子平衡调控和活性氧平衡调控，来发挥 各自的生物学功能。植物遭受生物或非生物胁迫时，会通过一系列的信号转导引发植物的 生理反应。在植物的信号转导过程中，CDPK与第二信使钙离子(Ca2+)结合，进而把Ca2+信号 转换成磷酸化信号，这一过程并不需要其它蛋白质的参与。CDPK是信号转导通路中重要的 保守传递体，逆境信号引发细胞质中Ca2+浓度变化产生的Ca2+信号，通过激活与感受各自信 号相对应的特定CDPK组分，使CDPK作用的底物发生磷酸化，致使各种Ca2+信号通过各自特定 的通路向下游传递，进而调控下游基因表达，调控生化代谢、离子和水分跨膜运输等参与对 信号响应的生物学过程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿耐盐基因 Ms⑶PK及其编码蛋白和应用。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007]本发明公开了一种紫花苜蓿耐盐基因 Ms⑶PK，该耐盐基因 Ms⑶PK的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.1 所示。
[0008] 本发明还公开了由上述的紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK编码的蛋白，该蛋白的氨基酸 序列如SEQ.ID.N0.2所示。
[0009] 本发明还公开了含有上述的紫花苜蓿耐盐基因 Ms⑶PK的表达载体，该表达载体为 植物表达载体pCBM-MsCDPK。
[0010]本发明还公开了扩增上述的紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK全长或其任意片段的引物 对。
[0011] 本发明还公开了上述紫花苜蓿耐盐基因 Ms⑶PK在植物抗盐胁迫中的应用。
[0012] 构建上述紫花苜蓿耐盐基因 Ms⑶PK的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体 通过农杆菌介导法转化到烟草组织中，筛选获得盐抗性增强的植物。
[0013] 本发明还公开了由上述的紫花苜蓿耐盐基因 Ms⑶PK编码的蛋白在植物抗盐胁迫 中的应用。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0015] 本发明从紫花苜蓿中获得MsCDPK基因的全长CDS，该基因的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本发明提供的MsCDPK 基因结构特性分析表明:Ms⑶PK基因⑶S全长为1650bp，该基因编码549个氨基酸。将其氨基 酸序列在NCBI 中Blast分析，发现与MtCDPK(蒺藜苜蓿，Sequence ID: ref | ΧΡ_003618125 · 1) 相比，氨基酸同源性为95%。本发明公开的Ms⑶PK基因为研究苜蓿抗盐分子机理及育种提 供理论依据。
[0016] 本发明公开了含有上述的紫花苜蓿盐胁迫响应基因 Ms⑶PK的克隆载体。进而构建 含有上述基因 MsCDPK的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化 到烟草组织中，筛选获得盐抗性增强的植株。将转基因烟草在含盐成分的MS培养基上培养， 结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐能力，转基因植物对盐的抗性显著高于野 生型，说明MsCDPK基因的过量表达提升转基因植株对盐的抗性，说明该基因参与植物的抗 盐过程。MsCDPK基因的功能鉴定有助于揭示紫花苜蓿的耐盐机制，对苜蓿的遗传育种，品种 改良具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 图1为MsCDPK的蛋白结构域；
[0018]图2为Ms⑶PK与其它物种的蛋白聚类树；
[0019] 图3为植物表达载体pCBM-⑶PK构建示意图：
[0020]图4为转Ms⑶PK基因烟草幼苗叶片PCR检测图；其中，"+"为阳性对照，为阴性对 照，"0"为空白对照，1-4为PCR获得的目的条带，与阳性条带一致，为转基因烟草植株；
[0021]图5为qRT-PCR分析转Ms⑶PK基因烟草株系的相对表达量结果；
[0022] 图6为Ms⑶PK转基因烟草L4与野生型烟草WT的叶圆片在盐胁迫处理下的表型实 验;其中，CK为600mmol L-lNaCl胁迫处理0天的Ms⑶PK转基因烟草L4与野生型烟草WT的叶 圆片，6d为600mmol L-lNaCl胁迫处理6天的Ms⑶PK转基因烟草L4与野生型烟草WT的叶圆 片；
[0023] 图7为MsCDPK转基因烟草L4与野生型烟草WT在600mmol L-lNaCl胁迫处理0天和6 天后烟草叶片的相对叶绿素含量；
[0024] 图8为MsCDPK转基因烟草L4与野生型烟草WT在600mmol L-lNaCl胁迫处理0天和6 天后烟草叶片的相对电导率。
【具体实施方式】
[0025]本发明公开的一种新的耐盐基因 MsCDPK，该基因是从紫花苜蓿中得到的，具体相 关实验如下：
[0026] 1、紫花苜蓿Ms⑶PK基因的获得
[0027] 在NCBI数据库中（http://www.ncbi · nlm.nih.gov/)搜索并下载已知的小麦 TaCDPK序列文本文件，从漠藜苜蓿基因组项目网站（http : //medicago . jcvi . org/ medicago/)下载漠藜苜蓿的数据库，应用在NCBI网站下载的ncbi-blast-2.2.30+软件进行 Local Blast，获得蒺藜苜蓿⑶PK基因序列。利用该序列设计引物，引物为：
[0028] MtCDPK-F:5 '-CAGAGGCGATGGGCAATACA-3 '；
[0029] MtCDPK-R:5，-GCCACGAGACTAATGAGCAC-3，。
[0030] 具体流程如下：
[0031] 1)提取RNA:利用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根)提取紫花苜蓿幼叶总 RNA；
[0032] 2)获得cDNA:以提取的RNA为模板，利用高效率逆转录试剂盒(Τ0Υ0Β0)获得cDNA， 并以此cDNA为模板RT-PCR扩增MsCDPK全长序列；
[0033] 3)PCR反应:用Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR反应，反应程序为：
[0034]
123456 4)将PCR产物连接到pMD18_T(TaKaRa)载体中的EcoRV位点； 2
[0036] 5)重组质粒转化到大肠杆菌T0P10中，进行测序(博仕生物公司）； 3
[0037] 6)最终鉴定得到MsCDPK基因0RF的全长序列。MsCDPK基因全长1650bp，该基因编码 549个氨基酸。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与Mt⑶PK相比，氨基酸同源性为 95%，具备CDPK的保守结构域，如图1所示。图2为MsCDPK与其它物种的蛋白聚类树。 4
[0038] 2、紫花苜蓿Ms⑶PK基因植物表达载体的构建 5
[0039] 1)以本发明中Ms⑶PK的⑶S序列，设计引物如下： 6 MsCDPK-F:5 '-ATGGGCAATACATGTCGTGG-3 '；
[0041 ] MsCDPK-R:5，-CTAATGAGCACTTGATGCGTCCC-3，。
[0042]以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增Ms⑶PK基因序列，反应程序如下：
[0043]
[0044]
[0045] PCR严物低温保臧备用。
[0046] 2)用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(TaKaRa)回收PCR产 物，将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞T0P10,挑取 转化阳性克隆提取质粒送测序，经过测序确定正确的阳性克隆用于后续实验。
[0047] 3)同时用BamHI和PstI对pCBM载体质粒进行双酶切，并用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(TaKaRa)回收pCBM载体片段，同时用BamHI和PstI双酶 切连有Ms⑶PK基因的T载体质粒，并回收Ms⑶PK基因。将回收的Ms⑶PK基因片段与pCBM载体 片段连接，然后后转化大肠杆菌感受态细胞T0P10，获得重组克隆。经过菌液PCR检测和提取 质粒的酶切鉴定后将正确的克隆命名为pCBM-MsCDPK，载体图如图3所示。
[0048] 3、农杆菌介导法转化烟草
[0049] 1)烟草的培养
[0050] 野生烟草SR-1种子30至40粒浸泡于75 %的酒精3min，之后用灭菌的蒸馏水冲洗5 至6次，再将种子浸泡于10 %的次氯酸钠原液15min，用灭菌的蒸馏水冲洗5至6次，将种子栽 培于MS固体培养基。种子萌发生长至幼苗时，移苗至装有MS固体培养基的大瓶中继续培养， 待用其叶片进行侵染实验。
[0051 ] 2)农杆菌菌液的制备
[0052] 挑取-80°C冻存的含有pCBM-MsCDPK质粒农杆菌EHA105甘油菌在YEB+50mg/L Rif+ 50mg/L Kan+50mg/L Str的固体培养基上活化培养，并在28 °C培养箱中倒置培养36-48h，将 活化得到的农杆菌单菌落接种于相同成分的YEB液体培养基中，28 °C振荡培养约16-24h。当 0D600 = 0.4-0.6时，取出培养液按照1:10接种相同成分的YEB液体培养基中进行二次活化， 当0D600 = 0.4-0.6时，将菌液倒入无菌的50ml的离心管，于4°C条件下，5000rpm离心10min， 弃去上清液，用MS培养液重悬菌体，用于后续转化。
[0053] 3)烟草的侵染
[0054]在超净工作台内，将重悬的农杆菌菌液倒入无菌培养皿中，将培养的烟草SR-1叶 片切至0.8_的方形，作为外植体置于菌液中浸泡8min，其间不断震荡。取出外植体置于无 菌滤纸上吸去附着菌液，叶背面朝上接种于诱导愈伤组织形成的培养基MSKMS+S.Omg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)，在25 ± 2°C条件下暗培养48-72h后，将MSi中的叶片移至MS2(MS+2. Omg/ L 6-BA+0.2mg/L NAA+l.lmg/L PPT+500mg/L Cef)培养基上进行筛选培养，每20d更换一次 诱导培养基。侵染过的叶片边缘长出新的幼芽时，切下幼芽放至MS3 (MS+1.3mg/L PPT+ 500mg/L Cef)培养基中进行生根培养，以待后续分子鉴定。
[0055] 4)转基因烟草DNA的提取
[0056] ①称取植物样品0. lg，置于1.5ml离心管中；
[0057] ②加入液氮研磨，向管中加入700μ1 65°C预热的2XCTAB Buffer缓冲液，轻柔混 勾，65 °C水浴45min，每5min轻柔的颠倒混勾；
[0058] ③将离心管取出冷却至室温，13000rpm室温离心10min;
[0059] ④取上清液，加入与上清液等体积的Tris-平衡酚和氯仿混合液(Tris-平衡酚和 氯仿体积比为1:1)颠倒混匀，4°C，13000rpm离心1 Omin;
[0060] ⑤取上清液，向管中加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇(氯仿和异戊醇体积比为 24:1)轻轻混勾，4°C，13000rpm离心 lOmin;
[00611⑥取上清液，加入上清液1 /10体积3mo 1 /L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙 醇(或等体积异丙醇），轻轻摇匀至出现絮状沉淀，置于_20°C醇沉30min;
[0062]⑦4°C，13000rpm离心 15min，弃去上清液；
[0063] ⑧加入500μ1预冷的70%乙醇洗涤，4°C，13000rpm离心10min，弃去上清液，空气干 燥；
[0064]⑨加入20μ1去离子水充分溶解。
[0065] 4、转Ms⑶ΡΚ基因烟草转化体的获得及转化体的PCR检测
[0066] PCR鉴定所需的Ms⑶PK基因内部引物如下：
[0067] MsCDPK GI plant F:5'-TGCTGTTCTTTCTCGTCTCA-3'
[0068] MsCDPK GI plant R:5'-TCAATCCTTCCATCGTTATCT-3'
[0069] 反应程序为：
[0070]
12345 参见图4,用Ms⑶PK基因内部引物进行PCR扩增，1-4的模板为提取的PPT抗性筛选 出的烟草植株的DNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示编号1-4为PCR获得的目的条带与阳性一致 (即能扩增出大约500bp的目标DNA条带），为转基因植株。其中，"+"为阳性对照（即以pCBM- Ms⑶PK表达载体质粒为模板的PCR检测结果），为阴性对照（即以野生型植株基因组DNA 为模板的PCR检测结果），"0"为空白对照，"M"为marker(DL2000)。 2
[0072] 5、转MsCDPK基因烟草株系的qRT-PCR检测 3
[0073]为探究目的基因在转基因株系中的转录情况，提取转基因植株的总RNA，反转录成 cDNA，后续用于qRT-PCR分析，检测Ms⑶PK基因在转基因植物中的转录水平。参见图5，结果 证明转基因植株均有目的基因的相应转录产物，而野生型植株则没有转录产物。 4
[0074] 6、转基因烟草植株功能的验证 5 1)配制600mmol L-SaCl培养液
[0076] 2)取生长状态相同的野生型和转基因烟草叶片，用7mm直径的打孔器打孔，用NaCl 培养液胁迫处理6天，观察叶片变化，记录并拍照。无论转基因烟草还是野生型烟草，在盐胁 迫下，随着NaCl处理天数的增加，叶片受损伤程度也逐渐严重，但总体来说，转基因烟草叶 片受损伤程度弱于对照。经600mmol I^NaCl处理6天后，野生型株系叶片变白，转基因株系 叶片变白数较少，参见图6。这说明MsCDPK基因在烟草中的表达能在一定程度上提高烟草对 盐胁迫的抗性。
[0077] 3)取上述胁迫处理6天的烟草叶片，提取叶绿素，测定其叶绿素含量。
[0078]实验方法如下：
[0079]①取O.lg烟草叶片放入预冷的研钵中，向研钵中加 lml预冷的80%丙酮，加入少量 石英砂进行研磨；
[0080] ②将研磨得到的液体转移至大离心管中，用80%丙酮洗涤研钵直至无色；
[0081] ③4°C，lOOOOrpm，离心5min;
[0082] ④取上清液且记录收取量；
[0083] ⑤向沉淀中加入80%丙酮，洗涤沉淀，再离心，直至沉淀无色(记录收取量）。注:收 取上清液的离心管暗处理。
[0084] ⑥样品测定:取3ml上清液在645nm和663nm处测吸光值(80%丙酮调零）；
[0085]⑦结果计算：
[0086] Ca=12.72A663- 2.59A645
[0087] Cb = 22.88A645-4.67A663
[0088] Ca-^ = 20.21A645+8.02A663
[0089] 叶绿素含量(mg · g-1 或mg · dm-2)=CXV/AX1000
[0090]式中：C为叶绿素浓度(mg · I/1) ;V为提取液总体积(ml) ;A为取样鲜重(g)。
[0091] 转基因植株和野生型植株在600mM氯化钠胁迫处理6天后，叶绿素含量皆大幅下 调。然而，转基因植株叶绿素含量的下降幅度明显小于野生型植株叶绿素含量的下降幅度， 参见图7。
[0092] 4)取同期且生长状态相同的野生型烟草和转基因烟草同一部位的叶片置于 600mmol L-lNaCl培养液中，胁迫处理6天，测其相对电导率实验方法如下：
[0093] ①将待用烧杯、量筒和三角瓶刷洗干净，再分别用蒸馏水和去离子水冲洗3遍，最 后用去离子水平衡12h;
[0094] ②将处理后的叶片用去离子水冲洗3次，滤纸吸去叶片表面水分，再用9mm直径的 打孔器在叶片上打孔，将获得的叶圆片，放入去离子水平衡过的三角瓶中，加入20ml去离子 水，每个处理设3个重复；
[0095]③将其抽真空15min，用电导率仪测其电导率，记录数值为S1，然后将三角瓶放入 沸水浴中加热20min，冷却至室温，用电导率仪测其电导率，记录数值为S2。
[0096] 相对电导率(L)计算公式如下:L = S1/S2X100%
[0097] 转基因植株和野生型植株在600mM氯化钠胁迫处理6天后，相对电导率皆明显提 高。然而，转基因植株相对电导率的上升幅度明显小于野生型植株相对电导率的上升幅度， 参见图8。
[0098]综上所述，本发明公开了紫花苜蓿盐胁迫响应基因 Ms⑶PK及其编码蛋白与应用， 属于基因工程技术领域。本发明公开的基因开放读码框全长1650bp，编码549个氨基酸。核 苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，利用核苷酸序列信息，获得该基因，构建该基因的克隆载体 以及植物表达载体，并通过农杆菌介导法将该基因转入模式植物烟草中，将转基因烟草培 养在含盐成分的MS培养基上，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐能力，说明 MsCDPK基因的表达提高了植株对盐的抗性，暗示了该基因能够参与植物的抗盐过程。本发 明的MsCDPK基因为研究苜蓿抗盐分子机制及育种提供理论依据，MsCDPK基因的功能鉴定有 助于揭示紫花苜蓿的耐盐机制，对苜蓿的遗传育种，品种改良具有重要意义。
【主权项】
1. 一种紫花苜蓿耐盐基因 MsCDM，其特征在于，该耐盐基因 Ms⑶的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.1 所示。2. 由权利要求1所述的紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨 基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。3. 含有权利要求1所述的紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK的表达载体，其特征在于，该表达载 体为植物表达载体pCBM-MsCDPK。4. 扩增权利要求1所述的紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK全长或其任意片段的引物对。5. 权利要求1所述紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK在植物抗盐胁迫中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，构建含有权利要求1所述紫花苜蓿耐盐基因 MsCDPK的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织 中，筛选获得盐抗性增强的植物。7. 权利要求2所述的蛋白在植物抗盐胁迫中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK105838726SQ201610318219
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】郭长虹, 杜秉昊, 张雪, 安逸民, 张军
【申请人】哈尔滨师范大学