一种用于检测K-ras基因突变的引物、探针及检测方法
【技术领域】：
[0001]本发明涉及K-Ras基因突变的一种检测办法、引物探针及检测方法，属于分子生物 学领域。
【背景技术】：
[0002] K-Ras基因是Ras家族的一员，该家族还包括H-Ras和N-Ras基因，被认为是一种癌 症基因。K-Ras基因是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路下游基因，可将细胞生长和分 化信号由激活受体传导于蛋白激酶，作用之一是维持细胞内环境稳定，与细胞增殖、凋亡有 关。K-Ras基因突变和过表达在肿瘤启动过程中具有重要的作用。研究表明K-Ras基因突变 能够激活其下游的Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/Akt通路，从而导致正常细胞转变为肿瘤细胞， 其突变与包括胰腺癌、肺癌等多种人类恶性肿瘤有关。
[0003] 我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位，且发病率已达5%，高于2%的国际 水平;每年新发病例约40万，其中30~40岁的中年人居多。近年来，靶向药物为大肠癌治疗 提供了新治疗方法，部分药物已经通过Π )Α审核作为转移性结直肠癌治疗药物，如抗VEGFR 的单克隆抗体帕尼单抗(Panitumumab)及西妥昔单抗(Cetuximab)。但是，仅部分患者能从 靶向治疗中获益，因此明确疗效预测因素非常重要。根据结直肠癌患者中K-Ras基因是野生 型还是突变型，将传统意义上的一种疾病分成两种独立的疾病进行治疗。结直肠癌患者中 K-Ras基因为突变型约占40%，野生型约占60%，目前临床治疗中抗EGFR靶向药物对野生型 大肠癌患者疗效显著，而对突变型无效，如不加区分采用同一种药物治疗将会增加不良反 应风险和治疗费用。因此，对K-Ras突变类型检测，可实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到 良好的预后，延长患者生存期。
[0004] K-Ras基因最常见的激活方式是点突变，其中90%发生在第一外显子第12、13位密 码子上，其中70%发生于第12位密码子，且多为GGT突变为GTT，30%发生于第13位密码子； 极少有文献报道第19、61、63位密码子发生突变。第12位密码子常用的检测方法主要有DNA 测序。
[0005] 目前常用检测K-Ras突变基因的方法为核苷酸序列测定法、基因芯片技术、及实时 荧光定量PCR法。其中核苷酸序列测定法可靠直观，并可检测出多位点变异，但耗时、灵敏度 低，尤其在混合模板时，最低检出极限在10%以上;基因芯片技术具有大通量、快速、灵敏、 平行检测基因优势，已在生物学的各个领域中广泛应用，但由于目前技术还不够成熟，所以 有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点变异;PCR-RFLP法能 有效鉴别不同基因型，简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检 验检测，但灵敏度不够，且该法操作中需开盖用PCR产物进行酶切，增加了产物污染的风险 造成污染;实时荧光定量PCR法实现了 PCR从定性到定量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、 重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中重要工具，基本解 决了过去实验过程因污染出现的假阳性，成为临床诊断中首选的核酸诊断技术。
[0006] 目前，突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS) 已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已 被业内专家广泛认可。ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，并利 用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检 测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测 序法等其他方法，可检测出样品中含量低至0.1-1.0%的突变基因；在设计上可以最大限度 地缩短目标产物的长度，可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到 准确检测结果的难点；结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处 理，能最大程度地避免扩增产物污染。用于检测EGFR、KRAS、BRAF等基因突变具有简单、方 便、快速、灵敏的优点，仅需90分钟即可得到准确结果，故易于在临床开展。
[0007] 本发明通过ARMS-PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因 K-ras 12密码子的6种突变情况:反应管A检测密码子12GGT>GAT、12GGT>AGT置换突变、12GGT>GTT 置换突变;反应管B检测密码子12GGT>TGT置换突变、12GGT>CGT置换突变、12GGT>GCT置换突 变，以此来预测爱必妥等分子靶向药物治疗效果。
【发明内容】
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[0008] 本发明目的是提供一种用于ARMS-PCR法检测K-ras密码子12突变情况的引物、探 针。
[0009] 本发明最终目的是通过自己设计的引物扩增目标序列，并用探针检测K-ras密码 子12突变情况，指导肿瘤患者对爱必妥等药物的治疗。
[0010] 基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0011]本发明采用AMRS-PCR法检测K-ras基因突变情况:利用设计的特异性引物探针配 置PCR反应液，加入人血液样本中提取的DNA，通过荧光实时定量PCR仪检测K-ras基因12密 码子2155位GGT 碱基突变为 GAT、AGT、GTT、GCT、TGT、CGT。
[0012]以上所述的引物探针序列如下：
[0013] (1) 12GGT>GAT置换突变的引物探针信息：
[0014] 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0015] 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0016] 探针PI: 5 ' -FAM-ACTAGTTGGAGCTGATC-BHQ-3 '
[00Π ] (2) 12GGT>AGT置换突变的引物探针信息：
[0018] 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0019] 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0020] 探针 P2:5 ' -HEX-ACTAGTTGGAGCTGATGC-BHQ-3 '
[0021 ] (3)12GGT>GTT置换突变的引物探针信息：
[0022] 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0023] 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0024] 探针 P3:5 ' -R0X-ACTAGTTGGAGCTGGTTC-BHQ-3 '
[0025] (4) 12GGT>GCT置换突变的引物探针信息：
[0026 ]上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0027]下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0028] 探针 P4:5 ' -FAM-ACTAGTTGGAGCTGGCTC-BHQ-3 '
[0029] (5) 12GGT>TGT置换突变的引物探针信息：
[0030] 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0031 ]下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0032]探针 P5:5 ' -HEX-ACTAGTTGGAGCTGTGTC-BHQ-3，
[0033] (6)12GGT>CGT置换突变的引物探针信息：
[0034] 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0035] 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0036] 探针 P6:5 ' -R0X-ACTAGTTGGAGCTGCGTC-BHQ-3，
[0037] (7)野生型的引物探针信息：
[0038] 上游引物F: 5 ' -GGCCAGAGGCTCAGCGGCTCCCAGG-3 '
[0039] 下游引物R: 5 ' -TCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTG-3 '
[0040] 探针 P7:5 ' -CY5-ACTAGTTGGAGCTGGGTC-BHQ-3，
[0041 ] -种鉴定K-ras密码子12突变情况方法，它是检测上述引物、探针鉴定K-ras密码 子12突变情况，包括如下步骤：
[0042] (1)引物探针的设计；
[0043] (2)配置ARMS-PCR反应体系；
[0044] (3)肿瘤患者血液样本基因组DNA抽提；
[0045] (4)利用步骤（1)特异引物对突变靶序列进行PCR扩增放大，利用探针对扩增产物 进行检测。
[0046] (5)结果分析
[0047] 本发明与现有技术相比，具有以下优势：
[0048] (1)具有更高特异性和灵敏度，可检测出样品中含量低至0.1-1.0 %突变基因；
[0049] (2)结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物后处理，能最大程 度地避免交叉污染和环境污染；