大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，包括步骤：a.提取肿瘤组织的基因组DNA；b.根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计一对PCR引物对，并设计一条与第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan?MGB荧光探针，对基因组DNA进行荧光定量PCR；c.根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，与阴性对照和阳性对照的结果进行比较和分析，从而鉴定基因组DNA中是否发生突变。还提供了相关检测试剂盒。本发明的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法设计巧妙，操作简单，可以筛检出可能对标靶药物有效的病人族群，检测结果准确可靠，从而可作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗，适于大规模推广应用。
【专利说明】大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病相关基因突变检测【技术领域】，更具体地，涉及大肠直肠癌相关基因突变检测方法【技术领域】，特别是指一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]目前癌症治疗除了化学治疗、手术切除、放射疗法等方式外，还有针对癌细胞进行攻击的标祀治疗(Target therapy)。标祀治疗是利用癌细胞中独特的结构或分子，以专一性的药物攻击这些特殊结构进而杀死癌细胞。最重要的是，标靶药物较不会攻击正常细胞，对正常细胞伤害较小，可减少许多副作用(如白血球、血小板降低、贫血、呕吐、掉头发等现象)，也可抑制癌细胞增长、转移与抗药性的恶性转化能力。标靶治疗也是近年来癌症治疗的新趋势，也是医学界最热门的研究重点，许多以此为目标的临床试验研究正持续进行中。[0003]根据研究显示大肠直肠癌的发生与其中癌细胞表皮生长因子受体表现有关，目前使用在大肠直肠癌的标靶药物有可与肿瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)结合，进而抑制EGFR作用的IgGl单株抗体的Cetuximab ( Erbitux? )及IgG2kappa单株抗体的Panitumumab ( Vectibix? ).其原理是它可以专一性地与EGFR结合，竞争性的抑制表皮生长因子的功能，使得癌细胞无法进行复制、繁殖与血管再生，诱发癌细胞走向死亡。EGFR，全名为Epidermal Growth Factor Receptor,中文名称为表皮细胞生长因子受体,是存在癌细胞和正常细胞膜表面的蛋白质，可传递细胞外生长、增殖以及抗亡的致癌讯号至细胞内，有可能会促成癌症的快速生长、转移与抗药性，患者的病况因而恶化。K-ras是EGFR下游的调控因子，为ras致癌基因家族成员之一，当K-ras基因发生突变时，会引起一系列的蛋白质磷酸化，造成更多细胞核转录因子的磷酸化，促使癌细胞过量的成长分裂。大部份的K-Ras基因的突变发生在第13号密码子。
[0004]由于每个病患间基因型态的差异对同样的标靶药物会产生不同的反应，而影响治疗效果。用药前的基因检测，可帮助医师与病患了解是否适合使用标靶治疗，量身订作个人化治疗，挑选适当药物，更有助于增加标靶治疗的专一疗效而达到更佳的治疗效果。大肠癌的标祀药物Cetuximab/Panitumumab是针对EGFR进行抑制,将其阻断,停止后续一连串的癌细胞进展，个人基因型态的差异会影响标靶药物抑制EGFR机制的作用结果。
[0005]大肠直肠癌与标靶药物之临床研究已有许多期刊报告可寻，相关新闻亦可利用搜寻网站键入“大肠癌标靶治疗”关键词搜寻。Lievre等人于2008年在J Clin Oncol期刊发表有关大肠直肠癌第一线化疗失败后，投与Cetuximab的研究指出:K_ras突变型对Cetuximab具有抗药性,而且疗效反应较差。再一次确认了 Cetuximab在K_ras野生型才具
有疗效。结论简报于下表:
[0006]
【权利要求】
1.一种大肠直肠癌相关基因κ-ras基因突变检测方法，其特征在于，包括步骤: a.提取肿瘤组织的基因组DNA; b.根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计一对PCR引物对，并设计一条与所述第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan MGB荧光探针，对所述基因组DNA进行荧光定量PCR ； c.同时以含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列的阴性对照以及含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列且所述第13号密码子为所述突变核苷酸序列的阳性对照为模板，采用所述PCR引物对和所述TaqMan MGB荧光探针进行荧光定量PCR ； d.将对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阴性对照和所述阳性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线分别进行比较分析，从而鉴定所述基因组DNA中是否发生突变。
2.根据权利要求1所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，所述PCR引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，所述阴性对照为阴性对照质粒 ，所述阴性对照质粒的插入片段为SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述阳性对照为阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的插入片段为SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，如果对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阴性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线一致，则所述基因组DNA中未发生突变；如果对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阳性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线一致，则所述基因组DNA中发生突变。
5.一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括引物容器、荧光探针容器、阴性对照容器和阳性对照容器，所述引物容器内具有根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计的PCR引物对干燥粉末或溶液，所述荧光探针容器内具有与所述第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan MGB荧光探针干燥粉末或溶液，所述阴性对照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列的阴性对照干燥粉末或溶液，所述阳性对照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列且所述第13号密码子为所述突变核苷酸序列的阳性对照干燥粉末或溶液。
6.根据权利要求5所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述PCR引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB突光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求5所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为阴性对照质粒，所述阴性对照质粒的插入片段为SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列， 所述阳性对照为阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的插入片段为SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
【文档编号】G01N21/64GK103923971SQ201310011985
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2013年1月11日
【发明者】赵翊均, 白小萍, 陆群 申请人:上海基康生物技术有限公司, 上海康期生物科技有限公司