一种人k-ras基因突变荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种人K-RAS基因突变荧光PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 临床上革E1向药物爱必妥（Erbitux，西妥昔单抗）和帕尼单抗（Panitumumab)仅 适用于无突变的K-RAS基因野生型患者，对K-RAS突变患者无效。美国国立综合癌症网络 (NCCN)将K-RAS检测列入《结肠癌临床治疗指南》。
[0003] K-RAS基因是公认的癌基因，最早2008年6月在美国临床肿瘤学会（ASCO)年会 上发布了临床研宄结果，即K-RAS突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良 反应的危险和治疗费用；而K-RAS野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10 月，K-RAS基因突变检测被写入最新版（2008年第3版）《美国国立癌症综合网络（NCCN) 结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者都应检测 K-RAS基因状态，二是只有K-RAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（如西妥昔单抗和帕 尼单抗）治疗。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-RAS基因如 果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向 治疗。
[0004] K-RAS基因的点突变（pointmutation)通常导致K-RAS从原癌基因 (proto-oncogene)向癌基因（oncogene)的转化。这样的功能改变对细胞的影响是多方面 的，因为K-RAS参与了许多控制细胞分裂与死亡的信号传导路径。目前研制的抗肿瘤药物 正是针对这样的K-RAS依赖性路径。然而，此类药物要应用于临床还得进行许多研宄才能 实现。具有突变的K-RAS在如下器官的恶性肿瘤中已得到鉴定：胰腺（90% )、结肠（50% )、 肺（30%)、甲状腺（50%)、膀胱（6%)、卵巢（15%)、乳腺、皮肤、肝脏、肾脏、某些类型的 白血病（leukemias)。在将来，有可能使用K-RAS来鉴定某些恶性肿瘤。胰腺肿瘤一直难于 诊断，但是在随粪便排出的胰腺细胞的DNA里，将K-RAS基因突变鉴定出来，则可帮助临床 医师鉴别胰腺炎与胰腺癌。
[0005] 随着人类医学和药物研宄水平的提高，药理遗传学（Pharmacogenetics)日渐兴 起。研宄表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在 个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研宄药物作用的 个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可 指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。
[0006] 随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测人K-RAS基 因突变，主要包括测序、基因芯片、探针杂交技术等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在人 K-RAS基因突变诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，人K-RAS基因突变的 实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越 性。
[0007] 而基于荧光PCR技术与等位基因特异性PCR技术（ARMS-PCR)结合检测人K-RAS 基因突变的方法被越来越多的研发人员尝试使用。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅 速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按 照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的 动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增 曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳 性结果。等位基因特异PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3 - 5外切酶活 性，在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计 适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。
[0008] 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术与ARMS-PCR技术检测人K-RAS基因突 变的试剂盒应用于临床检测中，然而此方法有很多不足之处：1)对于野生型背景的耐受能 力差，例如仅能耐受l〇ng野生型核酸的干扰，且经常出现假阳性；2)没有设置阳性内对照 (即内标），无法监控假阴性；3) -般没有预防PCR产物污染的措施。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于解决现有人K-RAS基因突变荧光PCR检测试剂盒的缺陷，提供 一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的人K-RAS基因突变荧光PCR检测试 剂盒。应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人K-RAS基因突变进行快速检测，为 诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。
[0010] 因此，本发明提供一种人K-RAS基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包 含检测其第12位和第13位密码子上的Glyl2Asp突变、Glyl2Val突变、Glyl2Ser突变、 Glyl2Cys突变、Glyl2Ala突变、Glyl2Arg突变和Glyl3Asp突变的上游引物序列K-M1、 K-M2、K-M3、K-M4、K-M5、K-M6 和K-M7 的七种PCR反应液，
【主权项】
1. 一种人K-RAS基因突变巧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含检测 其第12位和第13位密码子上的Glyl2Asp突变、Glyl2Val突变、Glyl2Ser突变、Glyl2切S 突变、Glyl2Ala突变、Glyl2Arg突变和Glyl3Asp突变的上游引物序列K-M1、K-M2、K-M3、 K-M4、K-M5、K-M6 和 K-M7 的^;：种 PCR 反应液， K-M1 为；5, -ATAAACTTGTGGTAGTTGGACCAGA-3，， K-M2 为；5, -AAACTTGTGGTAGTTGGACCAGC-3，， K-M3 为；5, -AATATAAACTTGTGGTAGTTGGGGATA-3，， K-M4 为；5, -AATATAAACTTGTGGTAGTTGGGGATT-3，， K-M5 为；5, -ATATAAACTTGTGGTAGTTGGATCAGT-3，， K-M6 为；5, -TATAAACTTGTGGTAGTTGGGGATC-3，， K-M7 为；5, -TTGTGGTAGTTGGAGCTTGAGT-3,。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每种PCR反应液中还均包含检测人 K-RAS基因突变的下游引物序列K-R和探针序列K-P， K-R 为；TATCTGTATCAAAGAATGGTCCTGC， K-P 为；CCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含内标序列，且在 每种PCR反应液中还包含检测内标的上游引物序列GB-F、下游引物序列GB-R和探针序列 GB-P， 内标序列为；5 ' -AAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTT GCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGAC-3^ ； GB-F ;5> -AAGTGCTCGGTGCCTTTAGTG-3>， GB-R ;5> -GTCCCATAGACTCACCCTGAAGT-3， GB-P ;5'-肥X-CCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAG-B册1-3'。
4. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括预防PCR产物 污染的酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶1U/ y 1?抓/ y 1和尿喀晚DNA糖 基化酶0. 05U/ y 1?0. 2U/ y 1 ;且在所述PCR反应液中还包含加TP。
5. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括K-RAS阳性对 照和K-RAS阴性对照。
【专利摘要】本发明提供一种人K-RAS基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含检测其第12位和第13位密码子上的Gly12Asp突变、Gly12Val突变、Gly12Ser突变、Gly12Cys突变、Gly12Ala突变、Gly12Arg突变和Gly13Asp突变的上游引物序列K-M1、K-M2、K-M3、K-M4、K-M5、K-M6和K-M7的七种PCR反应液。本发明提供的试剂盒在100ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假阳性情况，说明本发明试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人K-RAS基因突变进行快速检测，为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104531881
【申请号】CN201510011444
【发明人】戴立忠, 吴康, 龙凤英, 高堂杰
【申请人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月9日