猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，特别是涉及猪德尔塔冠状病毒荧光 定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒（PDCoV)，是一种新发现的冠状病毒， 2009-2010年H)CoV在中国香港首次报道该病毒。2014年初，在美国首次报道发病猪群，此后 至少有19个州有该新型冠状病毒的报道。
[0003] 目前检测猪德尔塔冠状病毒所采用的方法主要还是传统常规的病毒分离培养观 察鉴定、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离培养鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率 高;ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可 能造成误判。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性 高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的 PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在检测上受到一些限制。因此，有必要建立一 种快速、灵敏、准确度高的猪德尔塔冠状病毒检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，使其能够 快速、有效地对猪德尔塔冠状病毒进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括 具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针:上游引物:5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 '，下游引 物：5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 '，Taqman探针：5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 '。
[0007] 作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3'端标记MGB焚光淬灭基团。
[0008] 所述Taqman探针的核苷酸序列的5 '端标记FAM荧光报告基团。
[0009] 所述试剂盒还包括酶混合物，所述酶混合物包含HotMaster Taq DNA polymerase 和Quant RTase〇
[0010] 所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为猪德尔塔冠状病毒基因组cDNA。
[0011] 本发明的另一个目的是提供荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的非诊断性方 法，可对猪德尔塔冠状病毒快速、有效检测，且准确性、特异性和敏感性高。采用如下技术方 案：
[0012] 猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，采用具有如下核苷酸序列的 引物和Taqman探针进行荧光定量PCR:上游引物：5 ' -AGCCACCCACCAAACCAA-3 '，下游引物： 5 ' -TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3 '，Taqman探针：5 ' -TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3 ' 〇
[0013] 作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3'端标记MGB焚光淬灭基团。
[0014] 所述Taqman探针的核苷酸序列的5'端标记FAM荧光报告基团。
[0015] 所述荧光定量PCR的20μ1反应体系包括:上游引物0.4μ1;下游引物0.4μ1; Taqman 探针0·8μ1;检测样品RNA lyl;2XQuant One Step Probe qRT-PCR Master Mix 10μ1; HotMaster Taq DNA polymerase 0·8μ1;Quant RTase 0·28μ1;余量为灭菌去离子水。
[0016] 所述荧光定量PCR反应条件为：50 °C 30min，为第一步循环;92 °C 3min，为第二步循 环;92°(：108,601€208,68 1€208为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行 荧光信号检测。
[0017] 由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
[0018] (1)本发明根据国内已发现的CH/SXD1/2015猪德尔塔冠状病毒株（Genbank: KT021234.1)的N基因序列设计引物，合成特异性引物及Taqman-MGB探针，采用荧光定量PCR 方法快速灵敏地检测猪德尔塔冠状病毒，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。
[0019] (2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探针荧光定量 PCR检测法，使得利用Taqman-MGB探针法荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的灵敏度约是 普通PCR的100倍。
[0020] (3)由于采用定量检测技术-Taqman-MGB荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法 (Real-time PCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点， 有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。
[0021] (4)由于探针的3'端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上 的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。
[0022] (5)Taqman_MGB探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一 个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了 污染。
【附图说明】
[0023] 上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下 结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明。
[0024]图1是检测猪德尔塔冠状病毒的荧光定量PCR扩增曲线。
[0025]图2是猪德尔塔冠状病毒Taqman-MGB探针法荧光定量PCR特异性检测结果；图中， 1:猪德尔塔冠状病毒;2:灭菌的去离子水;3:猪流行性腹泻病毒;4:猪传染性胃肠炎病毒。 [0026]图3是猪德尔塔冠状病毒Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的敏感性检测结果；图 中，1:1 X 108PFU/mL; 2:1 X 107PFU/mL; 3:1 X 106PFU/mL; 4:1 X 105PFU/mL; 5:1 X 104PFU/mL; 6:1 X 103PFU/mL; 7:1 X 102PFU/mL; 8:1 X lO^FU/mL; 9:阴性样品（灭菌的去离子水）。
【具体实施方式】
[0027] 除非特别指明，以下实施例中所用毒株由北京亿森宝生物科技有限公司保存。
[0028] 除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商 购获得。
[0029] 实施例1荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的非诊断性方法
[0030] 1、设计引物和Taqman-MGB探针
[0031 ] 根据国内已发现CH/SXD1 /2015猪德尔塔冠状病毒株(Genbank: KT021234.1)的N基 因序列，找出猪德尔塔冠状病毒基因序列的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过 比对筛选，最终确定一组最佳引物和一条Taqman-MGB探针，目的片段为63bp，其核苷酸序列 为序列表中序列4。
[0032] 上游引物(PDCoV-F) :5'-AGCCACCCACCAAACCAA-3'（序列 1)
[0033] 下游引物(PDCoV-R) :5'-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3'（序列2)
[0034] Taqman探针（PDCoV-MGB) :5'FAM-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-MGB_3'（序列 3) 〇
[0035] 其中探针的5'端标记FAM报告荧光基团，也可以选择HEX等其他基团。焚光探针的 3 '端标记MGB淬灭荧光基团。淬灭荧光基团选择MGB的原因在于，TaqMan-MGB探针与传统的 TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：（1)提高TM值一平均15bases可提高18°C，这样可以 使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模 板间的TM值差异。（2)提高信噪比一由于在探针的3'端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并 且与报告基团在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。
[0036] 2、猪德尔塔冠状病毒RNA提取
[0037]利用总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP419)提取猪德尔塔冠 状病毒基因组RNA。放置于-20 °C备用。
[0038] 3、荧光定量PCR扩增：
[0039] 按照如下反应体系进行Taqman-MGB探针法荧光定量PCR:
[0040]
[0041]
[0042] 将一定量的检测样品即猪德尔塔冠状病毒RNA模板加入PCR管中（1次重复），放置 于荧光定量PCR仪中进行扩增。同时设置阴性对照，阴性对照为灭菌的去离子水。
[0043] 荧光定量PCR反应条件如下:50 °C30min，为第一步循环;92°C 3min，为第二步循环； 92°(：108,601€208,681€20 8为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧 光信号检测。
[0044]实验结果如图1，结果显示猪德尔塔冠状病毒RNA使用荧光定量PCR检测为