牛hif-1a基因转录水平荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA体外操作技术中最常 用的技术。PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同 一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片 段在反应液中呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)。
[0003] 荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机 分析技术所发展起来的基因定量方法。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧 光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA 的量变情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变 化达到阈值时的循环数);同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已 知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准 曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
[0004] SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA结合后，其荧光 大大增强，这种性质使其应用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约 为497nm，发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而没有掺入链中的SYBR染料分子不 会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
[0005] Northern blot技术可检测基因的转录水平，但整个实验过程操作比较复杂。 Northern blot实验中一个主要的问题是RNA容易降解，所以Northern Blot中所有的实 验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等，这使实验过程变得比较繁 琐。另外，Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的 伤害。
[0006] 基因芯片技术实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测 几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。
[0007] SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结 合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于 一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYB Green的灵敏度很高。但是，由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引 起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光值的变化可以帮助降低非特异 产物对定量结果的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到 的定量结果。
[0008] 缺氧诱导因子_1也称为低氧诱导因子_1 (Hypoxia Inducible Factor-1， HIF-1)普遍存在于人和哺乳动物的细胞中，常氧下虽有表达，但在缺氧条件下才可以稳定 表达。HIF-1是一种异源二聚体蛋白，由a和0亚基组成，g卩缺氧诱导因子-1A (Hypoxia Inducible Factor-lA，HIF_lA)和缺氧诱导因子 _1B (Hypoxia Inducible Factor-IB， HIF-1B)。HIF-1B亚基在细胞浆中稳定表达，而HIF-1A亚基在翻译后即被泛素-蛋白酶水 解复合体降解。在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到亚基的表达，而在缺氧状态下， HIF-1A亚基的降解被抑制，a和0亚基形成有活性的HIF-1，转移到细胞核内调节多种基 因的转录。因此，对HIF-1A基因的转录水平检测有助于鉴定动物对低氧环境的适应能力。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简便、快速，且 能够定量检测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛）缺氧诱导因子 -1A (Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1A)基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒。
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于检测牛HIF-1A基因转录水平 的引物对，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如 序列表中序列2所示。
[0011] 本发明的第二个目的是提供了用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，包括 有以下试剂：2XSYBR GREEN MIX、标准HIF-1A基因模板、上述的引物对和超纯水。
[0012] 进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述试剂盒中， 2XSYBR GREEN MIX、标准HIF-1A基因模板、上述的引物对和超纯水的配比为5mL :500 yL : 500 u L ：5mL〇
[0013] 进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述2XSYBR GREEN MIX 由以下试剂组成：Taq DNA 聚合酶 0? 1U/ y L、dNTPs 底物 0? 4 mmol/L、Mg2+ 5. 0 mmol/L、 KC1 100 mmol/L、Tris.HCl 20 mmol/L、明胶 0.02%、SYBR Green 染料。
[0014] 进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述标准HIF-1A基 因模板如序列表中序列3所示，标准HIF-1A基因模板的浓度为0. 8 y mol/L。
[0015] 进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，上述的引物对组成 的引物混合液中，引物一的浓度为8 ymol/L，引物二的浓度为8 ymol/L〇
[0016] 进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述超纯水的纯度 大于 18. 25 MQ. cm。
[0017] 本发明的第三个目的是提供了用于检测牛HIF-1A基因转录水平的荧光定量PCR 检测方法，包括以下步骤： 1) 配制荧光定量PCR反应预混液：取2XSYBR GREEN MIX 1000 yL、上述的引物对组成 的引物混合液100 y L、超纯水800 y L充分混匀，配制得到1900 y L的荧光定量PCR反应预 混液； 2) 将步骤1)得到的荧光定量PCR反应预混液按19 y L/管分装成100小管，加至荧光 定量专用PCR反应管或反应板中； 3) 配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准HIF-1A基因模板，以及未 稀释的标准HIF-1A基因模板，共6种，每种10 y L，用于检测基因的扩增效率； 4) 荧光定量PCR反应扩增：每个装有19 y L荧光定量PCR反应预混液的反应管或反 应板中分别加入1 y L待测cDNA、作为阴性对照的超纯水或作为阳性对照和计算扩增效率 标准的HIF-1A基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪中，95 °C下变性30 秒，然后按95 °C 5秒，55. 2 °C 20秒热循环40次，并在55. 2 °C时检测记录荧光信号； 5) PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶进行 PCR产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。
[0018] 进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，所 述步骤4)中，装有19 yL荧光定量PCR反应预混液的100个小管中，其中1管加入作为阴 性对照的超纯水、6管加入作为阳性对照和计算扩增效率标准的HIF-1A基因模板，其余小 管加入待测cDNA。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明提供的牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试 剂盒，可以有效检测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)、不同组织、不同时期的HIF-1A基因 的mRNA表达状态和表达量，同时可以鉴定该基因与动物低氧适应能力的相关性，以满足生 命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、 本发明实现了方便快捷的检测HIF-1A基因转录水平的目的；2、本发明在检测基因转录水 平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优势。
【附图说明】
[0020] 图1为HIF-1A基因转录水平荧光检测结果的扩增曲线。
[0021] 其中，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对焚光量值（Relative Fluorescence Units，RFU)，扩增曲线