专利名称：用于定量检测K-ras突变的试剂盒的制作方法
用于定量检测κ-ras突变的试剂盒
背景技术：
κ-ras基因属于ras癌基因家族，因其编码21kD的ras蛋白又名p21基因。K_ras 基因是EGFR信号通路的重要分子之一，其编码产物处在EGFR通路的下游，在肿瘤细胞的生 长、增殖、血管生成等过程中起着重要的“开关”作用。发生突变时，K-ras蛋白处于持续活性 状态，失去对细胞生长的正常调控，可导致细胞持续生长、阻止细胞凋亡。不同肿瘤组织中 K-ras基因突变率不同，其中胰腺癌82%，结肠癌43%，肺癌30%，甲状腺癌四％，膀胱、肝、 肾和子宫癌 10% 或低于 10% (BosJ.L.et al，Cancer Res, 1989,49(17) :4682-4689)。由 于突变K-ras的持续激活与EGFR活性是否被抑制无关，使得患者不能从抗EGFR治疗中获 益(Amado R. G. et al,J. Clin. Oncol. ,2008,26(10) :1626-1634 ；Lievre A. et al, J. Clin. Oncol.，2008 ；26(3) :374-379)。因此通过对K_ras基因的突变检测，可以对抗EGFR药物的 治疗效果做出一定的前瞻性评估，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。目前K-ras基因突变点主要集中于第12、13位氨基酸密码子(张健杰等，西安交 通大学学报，2005, ) =349-351 ；何晓文等，中华消化杂志，2002，22 (1) :26- )，其中12 密码子GGT碱基突变为GTT或GAT碱基为最常见的突变类型。本发明通过实时定量PCR方 法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因K-ras 12、13密码子5种类型的突变情 况，来预测爱必妥等分子靶向药物的治疗效果。本发明采用的检测方法具有以下几个优点操作简单，易于标准化。其它方法如 等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件；限 制性片段长度多态性实验需投入相当的人力操作，且不能定量。实验周期短，2小时内就可 以完成。不需要测序验证结果，而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周。敏感 度高，我们通过对实验条件进行优化，突变检测的敏感度可达到1 %，而直接测序法敏感度 20-50%。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性率高，且不能确定点突变的位置和类型； 定量准确，这是本发明实验方法最独特的优点，通过绝对定量法处理数据，从而绘制标准曲 线，精确测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例，辅助临床 诊断和用药。另外，本发明安全无毒性，其它方法如错配碱基的化学断裂法需要用到同位素 和剧毒化学试剂。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种K-ras基因突变的定量检测试剂盒。定量检测 K-ras 基因 12 密码子(SEQ ID NO 1 ；SEQ ID NO 2) 2155 位 GGT 碱基突变为 GTT、AGT、GAT 或TGT碱基；13密码子(SEQ IDNO 1 ；SEQ ID NO :2)GGC碱基突变为GAC碱基的情况。为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10 X Taq缓冲液、MgCl2, dNTP混合液及 可特异性扩增K-ras基因突变位点序列的PCR引物与可特异性识别野生型与突变型序列的 探针的定量检测试剂盒及检测方法(1)分别在K-ras基因12、13密码子突变位点附近设计上下游引物，以及根据每个 突变位点的突变情况设计特异性的探针，该探针可与K-ras特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合，从而确定该位点有无发生所检测的基因突变。(2)为精确定量所测K-ras突变比例，本发明设计了标准品。(3)对待测样品与标准品进行荧光定量PCR检测。(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品 核酸的K-ras基因突变占总体K-ras基因的比例。所述步骤(1)之前还包括对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与K-ras基因突变位置的碱基序 列特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所 述的荧光发射基团选自FAM、ΤΕΤ、HEX、R0X;所述的荧光淬灭基团选自BHQ、TAMARA。优选 地，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28。所述标准品至少包括质粒、基因组DNA或化学合成序列中的一种。优选地，所述标 准品包含野生型质粒和/或突变型质粒，其中野生型质粒包含K-ras基因野生型序列，突变 型质粒包含κ-ras基因突变型序列。更优选地，所述标准品由野生型质粒和/或突变型质 粒组成。所述待检样品包括新鲜组织、石蜡包埋组织、细胞株、血液、胸腔积液、腹腔积液、 唾液、消化液、尿液、唾液、粪便。所述引物由上游引物与下游引物组成。所述引物优选为SEQ ID N0:4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO :6,SEQ ID NO:7。所述的K-ras基因突变的定量检测试剂盒包括选自以下的试剂如上所述的 引物、探针和标准品。所述试剂盒优选还包括Taq酶、10XTaq缓冲液、MgCl2, dNTP混合 液。优选的引物与探针的比例为2 1-10 1，优选的正向与反向引物之间的比例为 1:3-3: 1。标准品包括以上所述的质粒按一定比例的混合，野生型质粒和突变型质粒的 含量的比例分别为0% -100%。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例2所用质粒标准品构建方法示意图。图2是本发明实施例2野生型质粒图谱，箭头所指即为载体中插入野生型PCR产 物序列的位置。图3是本发明实施例I-ras野生型质粒测序4是本发明实施例2突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。 其中图A是K-ras 12密码子GGT — GTT突变质粒测序图，图B是K_ras 12密码子GGT —AGT 突变质粒测序图，图C是K-rasl2密码子GGT — GAT突变质粒测序图，图D是K_ras 12密 码子GGT — TGT突变质粒测序图，图E是K-ras 13密码子GGC — GAC突变质粒测序5是本发明实施例3的标准品扩增曲线图，其中图A是K-ras野生型质粒标准 品扩增曲线，图B是K-ras 12密码子GGT — GTT突变质粒标准品扩增曲线，图C是K_ras 12密码子GGT — AGT突变质粒标准品扩增曲线，图D是K_ras 12密码子GGT — GAT突变质粒标准品扩增曲线，图E是K-ras 12密码子GGT — TGT突变质粒标准品扩增曲线，图F是 K-ras 13密码子GGC — GAC突变质粒标准品扩增曲线。图6是根据图4绘制的标准曲线图，其中图A是K-ras野生型质粒标准曲线，图B 是K-ras 12密码子GGT —GTT突变质粒标准曲线，图C是K-ras 12密码子GGT — AGT突 变质粒标准曲线，图D是K-ras 12密码子GGT — GAT突变质粒标准曲线，图E是K_ras 12 密码子GGT — TGT突变质粒标准曲线，图F是K-ras 13密码子GGC — GAC突变质粒标准曲线。图7是本发明实施例3检测的石蜡包埋组织样本K-ras 12密码子野生型(图A) 与GGT —TGT突变型(图B)荧光定量PCR扩增曲线图，新鲜组织样本K-ras 12密码子野 生型(图C)与GGT —GTT突变型(图D)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本13密码子野 生型(图E)与GGC —GAC突变型(图F)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本K_ras 12 密码子野生型(图G)与GGT — AGT突变型(图H)荧光定量PCR扩增曲线图。图8是本发明的定量方法示意图。
实施例以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明 的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意 指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版(Sambrook J.)，或按照厂商所 建议的条件。实施例1 人类新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织、外周血、胸水、人类细胞系基因组 DNA抽提我们所测试的人类癌细胞系包括非小细胞肺癌(NSCLC) (A549, H460、H838和 H1703)、乳腺癌(MCF-7、BT474 和 HuL 100)、恶性多间皮瘤细胞系(H513、H2052、H290、 MS-I和H28)、结肠癌细胞系(SW480)、头颈癌细胞系(U87)、子宫颈癌(Hela)、肉瘤细胞系 (Mes-SA,Saos-2 和 A204)。所测试的人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组织包括NSCLC、间皮瘤、结肠癌、 恶性黑素瘤、肾癌、食道癌、甲状腺癌、恶性毒瘤和卵巢癌。标本DNA抽提可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取试剂盒提取样本基 因组DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提DNA浓度与纯度 (0D260/0D280约为1. 8，0D260/0D230大于2. 0)。下面以使用Promega公司的DNA提取试 剂盒为例介绍样本DNA提取步骤1.新鲜组织DNA抽提(1)用剪刀切取约黄豆粒大小的组织，置于研钵中，将组织剪碎，加液氮研成粉末。(2)加入600 μ 1预冷的裂解液于研钵中，用Iml大枪头吹打6次，尽量使组织粉末 与裂解液混勻，转移混合物到1. 5ml EP管中，上下颠倒6次混勻后65°C水浴20分钟。(3)力卩3 μ 1的RNA酶，上下颠倒6次混勻，37 °C水浴20分钟。(4)冷却到室温，加200 μ 1蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混勻，冰上放置5分钟后13，000*g，室温离心4分钟。(5)转移上清至事先加600 μ 1异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混勻6次后 13，000*g，室温离心1分钟。(6)弃上清，加600μ1 70%乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混勻后 13，000*g，室温离心1分钟。(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小时或4°C过夜。2.石蜡包埋组织DNA抽提(1)将Img或少于Img的组织放入1. 5ml离心管内。(2)加入新鲜制备的100 μ 1温育缓冲液/蛋白酶K溶液。根据样品的类型，56°C 温育过夜。(3)取出温育的样品管，加入两倍体积的裂解缓冲液。(4)高速涡旋振荡树脂10秒钟至树脂完全悬浮，加入7 μ 1完全悬浮的树脂。高速 涡旋振荡3秒钟后室温温育5分钟。(5)高速涡旋振荡2秒钟，将管子放在MagneSphere 磁分离架上。磁分离立刻 进行。(6)小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。(7)加入100 μ 1裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。(8)将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液。(9)加入100 μ 1配制的Ix洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。(10)将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液。(11)重复步骤9和10两次，共3次洗涤，并确保在最后一次洗涤后，除去所有的液 体。(12)打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟。(13)加入25 μ 1洗脱液。(14)盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。65°C温育5分钟。(15)取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟。立即放到磁分离架上。(16)将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。3.全血DNA抽提(1)收集抗凝全血300 μ 1，加入900 μ 1细胞裂解液，用Iml枪头吹打混勻6次，尽 量使全血与细胞裂解液混勻，室温放置10分钟，期间用Iml枪头吹打混勻3次。(2) 13，000*g，室温离心20秒后弃上清，剧烈震荡，加入300 μ 1预冷的裂解液，用 Iml枪头吹打混勻至沉淀完全溶解。(3)加1. 5 μ 1的RNA酶，上下颠倒6次混勻，37°C水浴20分钟。(4)冷却到室温，加100 μ 1蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混勻，冰上放置5分钟后 13，000*g，室温离心4分钟。(5)转移上清至事先加300 μ 1异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混勻6次后 13，000*g，室温离心1分钟。
(6)弃上清，加Iml 70%乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混勻13，000*g，室 温离心1分钟。(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小时或4°C过夜。4.胸水DNA抽提(1)收集胸水5ml，2000rpm室温离心10分钟，取上清加入Iml细胞裂解液，颠倒混 勻6次，室温放置10分钟。(2) 13，000*g，室温离心20秒后弃上清，剧烈震荡，加入Iml预冷的裂解液，混勻至
沉淀完全溶解。(3)加3 μ 1的RNA酶，上下颠倒6次混勻，37 °C水浴20分钟。(4)冷却到室温，加200 μ 1蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混勻，冰上放置5分钟后 13，000*g，室温离心4分钟。(5)转移上清至事先加5ml异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混勻6次后 13，000*g，室温离心1分钟。(6)弃上清，加Iml 70%乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混勻13，000*g，室 温离心1分钟。(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小时或4°C过夜。5.细胞系DNA抽提(1)收集至少约IX IO6的细胞并转移至1.5ml的EP管中，13，000*g，室温离心10
秒，如果是贴壁细胞，收集细胞前要用胰酶消化。(2)弃上清，加200μ 1 PBS洗细胞，13，000*g，室温离心10秒后，弃上清，剧烈震荡
至沉淀混悬。(3)加入600 μ 1预冷的裂解液，用Iml大枪头吹打混勻至没有肉眼可见的细胞块。(4)力卩3 μ 1的RNA酶，上下颠倒6次混勻，37 °C水浴20分钟。(5)冷却到室温，加200 μ 1蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混勻，冰上放置5分钟后 13，000*g，室温离心4分钟。(6)转移上清至事先加600 μ 1异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混勻6次后 13，000*g，室温离心1分钟。(7)弃上清，加600μ1 70%乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混勻后 13，000*g，室温离心1分钟。(8)吸干乙醇，空气干燥15分钟。(9)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小时或4°C过夜。实施例2 含突变型与野生型检测序列的质粒标准品的准备1.野生型质粒构建(图1，图2)1. 1载体的准备TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。1. 2插入片段的准备使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经步骤1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件如下表(表1、表2、表3)
表 1 :PCR 反应体系(50 μ 1)
权利要求
1.一种聚合酶链式反应引物，其在适宜的PCR条件下与κ-ras基因突变位置的上下游 200个以内的核苷酸结合。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物与下游引物组成。
3.一种荧光定量PCR探针，其在适宜的PCR条件下与K-ras基因突变位置的碱基序列 特异性结合。
4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光发光基团，3’端 连接有荧光淬灭基团。
5.一种质粒，该质粒包含待检测的K-ras基因野生型序列。
6.如权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含的K-ras基因野生型序列为 SEQ ID NO :29。
7.一种质粒，该质粒包含待检测的K-ras基因突变型序列。
8.如权利要求7所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含的K-ras基因突变型序列为 SEQ ID NO 30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO 33 或 SEQ ID NO :34。
9.一种K-ras基因突变的定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括选自以下的 试剂如权利要求1或2所述的引物、权利要求3或4所述的探针、以及权利要求5和/或 7所述的质粒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，引物与探针的比例为2 1-10 1，正 向与反向引物之间的比例为1 3-3 1。
全文摘要
本发明涉及用于定量检测K-ras突变的试剂盒。具体地说，本发明涉及与分子靶向抗癌药物疗效相关的K-ras基因突变检测方法及检测试剂盒。尤其涉及一种在K-ras基因突变热点区域检测突变的荧光定量PCR检测方法、试剂盒及其应用。本发明对K-ras基因特定位点的突变进行检测，并可对分子靶向抗肿瘤药EGFR酪氨酸激酶抑制剂进行疗效预测，进而对肿瘤患者的临床个体化用药方案提供指导。
文档编号C12N15/11GK102115782SQ20091021583
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者许军普, 陈钊 申请人:北京雅康博生物科技有限公司