一种armc5基因检测试剂盒及突变位点的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种ARMC5基因检测试剂盒及突变位点，所述试剂盒针对ARMC5基因。所述突变位点为p.R362*(c.1084C>T)、p.A871T(c.2611G>A)、p.R410W(c.1228C>T)、p.R888*(c.2662C>T)或p.A174V(c.521C>T)。本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，发现了18种不同的突变位点中，有1种是非致病性突变，而其余17种均为致病性基ARMC5基因突变，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【专利说明】
一种ARMC5基因检测试剂盒及突变位点
技术领域
[0001] 本发明属于库欣综合征领域，特别涉及一种ARMC5基因检测试剂盒及突变位点。
【背景技术】
[0002] 虽然早在50多年前就已经明确了TOMAH的临床表现，但该病的病理进程尚未完全 明确。PBMAH表现出异常高分泌的皮质醇水平而血清ACTH被抑制。这些现象的机制非常复 杂。以往的研究提出PBMAH的皮质醇高分泌现象可能并非受到ACTH的调控而是由于其他激 素的作用，并因此被命名为非ACTH依赖性肾上腺大结节样性增生症（AIMAH)。他们认为 PBMAH病人的肾上腺皮质束状带细胞通过异位表达其他激素的G蛋白偶联受体而刺激了皮 质醇的分泌增加。然而，目前尚不能肯定这些受体的表达是由于PBMAH病理进程导致的原发 性反应或者是由于细胞增殖和去分化而出现的继发性现象。此外，异常激素受体表达的基 因编码区或者启动子区均未发现任何基因突变。目前尚无法解释这一现象的产生原因。近 年来，研究者们发现PBMAH的皮质醇分泌仍然主要由ACTH调控，但ACTH并非完全来源于垂 体，患者额的肾上腺类固醇合成细胞的亚组也可以合成ACTH。PBMAH患者的肾上腺增生组织 通过这些类固醇合成细胞亚组中产生的ACTH进行自分泌或者旁分泌调节，从而严重影响皮 质醇分泌。这些肾上腺皮质细胞中异常表达分泌的ACTH是一种继发性的PBMAH病理进展。该 现象来源于不同的分子缺陷，且在散发病例和遗传性家系中均存在。PBMAH曾经被命名为非 ACTH依赖性肾上腺大结节性增生症(A頂AH)，但基于上述的重要发现，该命名不再适用。因 此将这一疾病名称更改为原发性肾上腺大结节性增生症(PBMAH)。
[0003] PBMAH发生必定累及双侧肾上腺这一临床证据支持了该病的发生可能具有胚系基 因突变倾向的假说。这与之前频繁报道的肾上腺小结节性增生症相似。虽然PBMAH病例大多 是散发病例，但也曾有少数家系被报道过。研究者们普遍认为该病极有可能是基因来源的 疾病。曾有一些极其罕见的婴幼儿PBMAH病例被报道，大多数是McCune-Albright综合征的 病例。McCune-Albright综合征的病因是Gs-(刺激性G蛋白亚单位)基因的激活突变而导致 cAMP信号通路的激活。在成年早期，PBMAH与多发性内分泌腺瘤病1型(MEN1 )，家族性腺瘤性 息肉病，遗传性平滑肌瘤病肾癌综合征(fumarate hydratase基因突变)有关。此外，PBMAH 研究者们还提出了另一个假说:ACTH受体基因(MC2R)的激活突变导致了皮质醇分泌本质的 改变，该假说虽然看似被证实了，但所有文献中仅有1例报道。另外，Fragoso等人首次报道 了 1例携带体细胞Gs基因激活突变的PBMAH女性成年患者，然而她并未出现McCune-Albrigh 综合征的其他临床表现。然而，大多数PBMAH患者在50岁以上才能得到诊断(往往在明确诊 断前已经有轻微库欣综合征症状），且这些患者并非已明确的多发性肿瘤综合征。虽然大多 数中老年PBMAH患者是散发病例，但仍有少数家系遗传性聚集现象存在。除了上述已报道的 病例(MEN1、APC和FH)之外，在剩下的PBMAH患者中尚未发现任何与这些综合征相关的基因 突变。为了进一步阐明该病的病理生理进程，科学家们对PBMAH患者们进行了全基因测序。 研究者希望能明确与疾病发生有关的病理性胚系突变。研究结果发现了位于16pll. 2上的 ARMC5基因在PBMAH患者中有较高的突变率。这一结果越来越被科学家们重视。在33例散发 PBMAH患者中，有55%的病例出现了ARMC5基因的杂合性胚系突变，并导致了ARMC5蛋白的表 达水平下降。对肾上腺切除术患者术后的肾上腺结节进行分析后发现，肾上腺组织中还携 带了额外的结节特异性体细胞ARMC5基因突变或者杂合性缺失(LOH)。这支持了双等位基因 ARMC5基因突变作为肿瘤发生二次打击的理论。随访研究也在发生库欣综合征的PBMAH患者 中证实了ARMC5胚系突变，而且在一个人数众多的巴西家系中发现了ARMC5胚系突变和体细 胞突变同时出现，进一步证实这个抑癌基因对于PBMAH发生和进展的重要作用。有趣的是， 在这个巴西家系的7例PBMAH患者中有3人并发了颅内脑膜瘤，说明ARMC5基因的突变可能导 致其他肿瘤的形成。然而，随访的过程非常费时费力，且许多并未携带基因突变的家族成员 会受到额外的伤害，其中包括肾上腺影像学研究带来的射线暴露等问题。对于已经明确携 带ARMC5基因突变的PBMAH患者的家系基因学研究可以筛选出有发展为PBMAH可能的ARMC5 基因突变携带者，并使其得到更多的靶向筛查和周期性随访而实现早期诊断。其他未携带 致病性基因突变的家族成员则可以免于额外的伤害。
[0004] PBMAH患者的ARMC5基因突变率在不同地区和人种之间可能存在多样性，例如欧洲 的PBMAH患者ARMC5基因突变率约54%。目前尚无关于中国的PBMAH患者ARMC5基因突变的研 究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种ARMC5基因检测试剂盒及突变位点，该试 剂盒检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，发现了 18种不同的突变位点中，有1种是非 致病性突变，而其余17种均为致病性基ARMC5基因突变，为临床上患者的个体化治疗、预后 判断和预防干预提供便利。
[0006] 本发明的一种ARMC5基因检测试剂盒，所述试剂盒含有下列引物对：
[0018] 所述试剂盒还包括DNA提取试剂、Fastpfu酶、PCR缓冲液和dNTP混合物。
[0019] 所述试剂盒的PCR反应条件为:预变性95 °C 2分钟;变性95 °C 20秒;退火58或60 °C 30 秒;延伸72°C lkb/60秒;共35个循环。
[0020] 所述试剂盒的PCR反应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察 并确认条带位置。
[0021] 本发明的一种A RM C 5基因检测试剂盒检测得到的突变位点，所述突变位点为 p.R362*(c.l084C>T)、p.A871T(c.2611G>A)、p.R410W(c.l228C>T)、p.R888*(c.2662C>T)或 p.A174V(c.521C>T)〇
[0022] 图1中：
[0023] Armadillo repeats :Armadillo重复序列，每一个Armadillo序列由一对α螺旋结 构构成发夹结构。ARMC5基因中存在7次重复的Armadillo重复序列。
[0024] BTB(POZ)domain:BTB为BR_C，ttk and bab域；Ρ0Ζ为（Pox virus and Zinc finger)域，常见于锌指蛋白，包含Kelch模体以及痘病毒蛋白家族。主要结构为一组α螺旋 结构，在顶部和底部的两侧为短链β折叠。可能功能为调控转录抑制。目前ARMC5基因的蛋白 结构域功能研究尚待进一步完成。
[0025] 有益效果
[0026] 本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，发现了18种不同的突变位点中， 有1种是非致病性突变，而其余17种均为致病性基ARMC5基因突变，为临床上患者的个体化 治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【附图说明】
[0027] 图1为ARMC5基因突变位点示意图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0029] 实施例1
[0030] 1、外周血DNA抽提
[0031]使用QIAampDNA FFPE Tissue Kit提取DNA，流程如下：
[0032] 1)将水浴锅调整至56。(：预热。
[0033] 2)取200u 1 AL液于1.5ml离心管中，加入40u 1的蛋白酶K。将全血吹打混匀后用移 液器吸取200ul加入离心管内，剧烈振荡15秒混合均匀。
[0034] 3) 56 °C水浴30分钟，离心管内液体颜色变为绿色。离心数秒，将液体集中。
[0035] 4)加入200ul的无水乙醇裂解细胞并混匀。振荡一次。并且离心数秒。
[0036] 5)将基因分离组DNA分离柱置于一个2ml的收集试管中，将上步得到溶液转入柱子 中，8000rpm离心lmin，弃去该收集试管和流出液。
[0037] 6)置柱子于另一收集试管，用500ul的AW1溶液洗涤DNA，8000rpm离心lmin，调整离 心机速度至14000rpm，离心3min。弃去该收集试管及流出液。
[0038] 7)置柱子于另一新的收集试管，加入500ul的AW2溶液再次洗涤DNA，14000rpm，离 心3min。弃去流出液。
[0039 ] 8)使用新的的收集试管，用14000rmp离心lmin以甩干柱子。
[0040] 9)将柱子置于一新的收集管，加入200ulAE溶液用于洗脱DNA，在空气中放置30min 左右。
[0041 ] 10)将柱子以8000rmp离心1.5min，以洗脱DNA。保留DNA流出液。将流出液重新放入 柱子中，再次静置lOmin，随后8000rpm，1.5min离心。弃去柱子。保留DNA流出液。
[0042] 11)已AE作为空白对照，使用分光光度法测定提取得到的DNA浓度。
[0043] 12)储存在于_20°C恒温冷冻箱。
[0044] 2、DNA琼脂糖凝胶电泳分析
[0045] 主要缓冲液及试剂配方：
[0046] 1)50X TAE缓冲液 Tris' 242g； 100% 乙悛 57.1mL；
[0047] 0.5M ΕΟΤΑ,ΡΗΒ.Ο lOOmL； 单蒸水 记界个:1L,,
[0048] 搅拌溶解后存于室温，工作。
[0049] 实验步骤：
[0050] 1) 1.5 %的琼脂糖凝胶的制备：用电子天平称量1.5g琼脂糖粉剂，倒入清洁锥形瓶 中，再用量筒量l〇〇ml的ΙχΤΑΕ缓冲液倒入瓶内，轻轻摇匀，于微波炉内加热至沸腾使其充分 溶解，待其稍冷却至60°C后用移液枪加入8μ1 gelrecKlOOmL溶液加8μ1 gelred)，晃动锥形 瓶使其混匀。将凝胶倾注于两端密封的制胶板内，厚度约3_，垂直放入齿梳于板内，放置在 室温下30分钟使其充分凝固，拔去梳子。
[0051] 2)上样:将制胶板置于电泳槽中，注入1XTAE缓冲液，使电泳缓冲液液面高出胶平 面l-2ml。取2μ1 DNA模板，加4μ1 ddH20,再加 ΙμL溴酚蓝(凝胶中呈蓝紫色)和二甲苯青(凝 胶中呈蓝色)混合loading buffer，混勾后将样品加入梳孔中。
[0052] 3)电泳：用水平电泳槽进行电泳，上样品端接负极。调节电压电流，电压约为120V， 电流约为400mA，恒压电泳约30分钟，根据指示剂迀移距离判断是否终止电泳。
[0053] 4)检测:关闭电泳仪，将电泳后的凝胶置于凝胶成像系统摄片。
[0054] 3、引物序列
[0056] 4、PCR反应体系及条件
[0057] PCR扩增体系为：
[0058] 5XPCRBuffer(Mg2+)：6ul；
[0059] dNTP(2.5mM)：3ul；
[0060] 正向引物(F，10P):0.5ul;
[0061] 反向引物(R，10P):0.5ul;
[0062] Fastpfu酶（2·5U/ul):lul;
[0063] 模板 DNA:100ng;
[0064] ddH20补足至总体积为30ul;
[0065] PCR扩增条件：
[0066] 预变性95 °C 2分钟；
[0067] 变性 95 Γ 20 秒；
[0068] 退火58/60°C30秒(pirmer3a、3b和2的退火温度为60°C，其余均为58°C);
[0069] 延伸 72°Clkb/60 秒；
[0070] 共35个循环。
[0071 ]反应结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并确认条带位置。 [0072] 5、Sanger法基因测序
[0073] 使用美国ABI3730XL测序仪，测序方法为Sanger等在1977年发明的双脱氧链末端 终止法。具体原理如下：
[0074]利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止 核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核 苷三磷酸（dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)。由于ddNTP缺乏延 伸所需要的3'_0H基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中 相应的双脱氧核苷三磷酸决定。每一种dNTP和ddNTP的相对浓度可以调整，使反应得到一组 长几百至几千碱基的链终止产物。它们有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过 高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同 位素标记进行检测。
[0075] 6、胚系ARMC5基因突变情况
[0076] 对34例PBMAH患者的外周血有核细胞中提取DNA后进行ARMC5基因 PCR扩增后直接 测序，共24例患者被检出携带ARMC5基因编码区胚系突变，基因突变率为70.6%，略高于欧 洲人群的55%。所有突变均为杂合突变，ARMC5基因突变情况详见表1。其中发生氨基酸改变 的有:6种移码突变、5种无义突变和7种错义突变。其中，2、9、10号患者携带相同的错义突 变：p.R410W(c. 12280T) ;5例患者（3、8、21、22、27号）携带相同的无义突变：？.1?362* (c.1084C>T)。这一现象与founder effect效应有关，即这些拥有同样突变的人可能来源于 同样的祖先，而这些位点恰好位于相对保守的区域内。所有胚系突变中，5种(共计11人）已 在先前的研究中报道过，均被预测为致病性突变。其中2种突变在本研究人群中的出现率明 显高于数据库中数据：P. R362*(rs369721476) (15vs0.01 % ;Ρ〈0· 001) (Exome Variant Server,http://evs.gs.Washington.edu/EVS/)and p.A87IT(rs190720368)(3vs0.12%；P = 0.05)(1000genomes project，http://www · 1000genomes.org/) ·此外，p.R410W ((：0 5]\1970282)和口.1?888*((3.2662〇1')被报道在(：0 5]〇(：数据库（11以口：// cancer, sanger.ac.uk/cosmic/)。该数据库为体细胞突变库，没有提供任何人群突变频率 的数据。还有P.A871T(rsl90720368)目前在数据库中缺乏人群突变频率数据。
[0077]在这些错义突变之中，31号患者携带的p.A174V(c.521C>T)尚未被在任何数据库 或者文献中报道。该基因型被silico模型预测为良性，故而将其定义为非致病性突变。其余 ARMC5胚系突变的预测结果均为:致病性突变，既突变导致致病性蛋白变化或者蛋白缩短 读1)。
[0078]总而言之，在34例PBMAH患者中发现24例携带ARMC5基因突变，共计18种不同位点 的杂合性胚系突变(图1)。
[0079] 表！ 24例携带ARMC5基因突变的PBMAH患者
[0081 ] 注，Patients with PBMAH:原发性双侧肾上腺大结节性增生症患者；
[0082] b cDNA change :cDNA的变化；
[0083] 。Protein:表中有2列，左列为氨基酸改变，右列为位点被报道的情况(被报道过 的均已标出序列号KARMC5基因的Ensembl基因转录本编号为ENST00000408912，UniProt肽 链序列编号为J3KQ26;
[0084] d Mutation taster:评分(括号内）代表了预测结果的可能性；当结果越接近1，说 明该预测结果具有较高的可信度；
[0085] e Polyphen:评分(括号内）代表了突变位点为有害性的可能性；当数值越接近1 时，说明该基因突变位点导致疾病发生的可能性越大；
[0086] f SIFT:评分(括号内）代表了氨基酸改变不影响蛋白质功能的标准化可能性；当 数值越接近〇时，越有可能是致病性突变；
[0087] g Predicton:由于Polyphen2和Sift只能预测错义突变，所以错义突变的最后预 测结果是由三种之中至少两种共同的结果决定。而无义突变和移码突变主要依据Mutation Taster的结果来判断。Damaging表示最后预测结果为该突变位点是致病性突变。Benign表 示最后预测结果为该突变位点是非致病性突变。
【主权项】
1. 一种ARMC5基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有下列引物对： primerI F：TAGTGGATGGGCAGGTGGGA；R：CGAGTGCCGGAAATGTGGAC； primer11 F：GATTCTCCCTCGCCTCTTCT；R：GGACCGCCTTTTCTCCTCTA； primer3a F：TTCCGGGGTCGAGAACTACA；R：TTCCGTACAGCAATCGGCTA； primer3b F：GAAGCCAACCCTCACGGACT；R：GATGCGCCATCACAAAGCAC； primer2 F：AGGGGTAGAACCCTCACAAG；R：CACTCAAGCCTTTCTTCTGC； primerVa F：GTTGGGGTCTGCTAGGGCTT；R：TTGGGCTAGCTCCATTAGGA； primerVb F：GCCTGTGCTGAGCAGCTAAG；R：AATAGGAACTGGCAGGTGGTC； primer4a F：TTGGCTCTGGGTTCAGTCTC；R：GAGTGGGAAGGTGAGGTTCT； primer5 F：GTCTCACTCACCCCACCTGT；R：ACAGTGGGAGACACCAGGTC； primer6a F：ACACCCGCTCTTCCTCTTCT；R：CTCTTCCAGCTCCTCCTCCA； primer6b F:CTGCTGGCCGTTTCCTACTG;R:GAACAAGACCCTGCTTGGTG 〇2. 根据权利要求1所述的一种ARMC5基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括 DNA提取试剂、Fas tpfu酶、PCR缓冲液和dNTP混合物。3. 根据权利要求1所述的一种ARMC5基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的PCR反 应条件为:预变性95 °C 2分钟；变性95 °C 20秒;退火58或60 °C 30秒;延伸72 °Clkb/60秒;共35 个循环。4. 根据权利要求3所述的一种ARMC5基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的PCR反 应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并确认条带位置。5. -种如权利要求1所述的ARMC5基因检测试剂盒检测得到的突变位点，其特征在于： 所述突变位点为P · R362*、p · A871T、p · R410W、p · R888*或 p · A174V。
【文档编号】C12Q1/68GK105950771SQ201610536654
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】王卫庆, 王凯, 叶蕾
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院