本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用pcr扩增检测结合耐高温限制性内切酶处理检测血浆游离dna中kras基因突变的试剂盒及方法。
背景技术：
：k-ras基因最早发现与上世纪八十年代初，首先从人膀胱癌细胞系中分离出一种转化基因，可使nih3t3细胞发生恶性转化，而从正常人组织中提取的dna则无此种作用。k-ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——h-ras、k-ras和n-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。k-ras基因就像体内一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的k-ras基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。在不同的癌症当中存在不同的kras突变的比例：胰腺癌(90％)、结肠癌(50％)、肺癌(30％)、卵巢癌(15％)、甲状腺癌(50％)、膀胱癌(6％)，红斑性狼疮(sle)、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎(ra)、肾癌及某些的白血病(leukemia)都有较高的突变水平。及时的检测kras意义很大，检测k-ras基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。(1)k-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的k-ras基因高度保持一致。一般认为，k-ras基因状态不会因治疗而发生变化。(2)k-ras基因突变见于20％的非小细胞肺癌(nsclc)，其中肺腺癌占30％～50％。循环肿瘤dna(ctdna)突变检测是近年来兴起且发展迅速的肿瘤诊断技术，称为“液体活检”。ctdna是指肿瘤细胞体细胞dna经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统；随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctdna来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。因此，ctdna是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。与组织活检相比ctdna检查微创小、无放射性污染、经济、新dna无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。由于ctdna含量低(<1.0％总cfdna)，片段短(180-200bp)，半衰期短(～2小时)，故其检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战。目前具备极微量核酸基因突变检测能力的技术主要有arms技术(包括super-arms)、第二代测序(ngs)和数字pcr(ddpcr，包括beaming技术)等。ngs技术可检测未知突变且检测基因数量不受限，在肿瘤耐药突变的监测与研究等领域有很大的应用潜力。然而，ngs建库技术复杂，常规建库测序方法使得血浆中含量极低的肿瘤信号完全淹没在背景噪声中，建库过程原始信息丢失严重或成为敏感度潜力发挥的限制因素。数字pcr技术，具有极高的敏感性，可绝对定量，但该方法检测通量较低。由于，ctdna含量极少，且肿瘤dna分子存在的数量远远不及正常细胞的dna，肿瘤相关dna被来自正常细胞dna严重稀释，单分子丰度仅0.01％，化验结果特别容易被干扰。因此，能够特异性的丰富样品靶序列的富集技术是液体活检技术发展的关键。技术实现要素：本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于富集技术的循环肿瘤dna(ctdna)k-ras基因c.35g>a、c.35g>t、c.35g>c突变的检测试剂盒及方法。通过靶向富集血浆游离dna中k-ras基因c.35g>a、c.35g>t、c.35g>c突变基因片段，提高该突变的检测灵敏度。为达到上述发明目的，本发明的技术方案为：所述检测血浆游离dna中k-ras基因突变的试剂盒中含有特异性引物对和耐高温的限制性内切酶；所述特异性引物包括序列如seqidno.1(agacatcgtaggtagtgacaaagctttgactgcatacaaacttgtggtagttggac)所示的正义引物和序列如seqidno.2(caatatgttcctgcggtaaagcgtcaggatccttagaccatattcgtccaca)所示的反义引物；所述耐高温的限制性内切酶bsrⅰ内切酶。所述试剂盒中还含有高保真dna聚合酶和pcr常规组件。优选地，所述高保真dna聚合酶为hotstartaqplusdna聚合酶。所述pcr常规组件包括dntp混合液、含镁离子的pcr反应缓冲液、去离子水。基于试剂盒检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的方法包括如下步骤：(1)按照血浆游离dna常规提取方法提取血浆游离dna；(2)采用本发明所述试剂盒进行pcr反应；(3)将步骤(2)获得的pcr产物送去一代测序，并通过与genebank中记录的序列做blast一致性分析，判断突变情况。即，利用sanger测序法分析pcr产物中是否有突变存在。其中，步骤(2)所述进行pcr反应的具体过程分为三步：a)采用试剂盒中的特异性引物对、高保真dna聚合酶、pcr常规组件构成的pcr反应体系，进行pcr反应；b)在pcr反应过程中加入试剂盒中的耐高温的限制性内切酶，并于65℃酶切反应1h；c)酶切反应结束后继续进行pcr反应。优选地，步骤a中所述pcr反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。步骤c中所述pcr反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。下面对本发明作进一步说明：利用本发明所述试剂盒检测时，pcr反应共分三步进行：①配置不含限制性内切酶bsrⅰ的pcr反应体系(25μl)，以步骤(1)获得的血浆游离dna为模板，进行pcr扩增；pcr反应的条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec(15cycles)；②在步骤①反应结束后，往pcr反应体系中加入0.8μl限制性内切酶bsrⅰ；65℃反应1小时；③在步骤②反应结束后，接着进行pcr反应；95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。步骤①中，每25μlpcr反应体系中的组分如下：正义引物0.4μl，反义引物0.4μl，模板dna2μl，10×pcrbuffer(含硫酸镁)2.5μl，dntp混合液(每种10mm)0.5μl，hotstartaqplusdna聚合酶0.3μl，余量为去离子水；步骤②中所使用的限制性内切酶bsrⅰ是耐高温的，在pcr反应用不会出现热失活，且其特异性识别序列为5’-actggn-3’(n＝aortorcorg)，正好能识别k-ras基因c.35位密码子的区域，当kras基因c.35位密码子为野生型(g)时，bsrⅰ酶可将dna双链切断；当c.35位密码子出现g>a、g>t、g>c突变时，由于内切酶严格的序列特异性，bsrⅰ酶将不c.35能识别该序列，不能将dna双链切断。本发明利用耐高温的限制性内切酶(bsrⅰ)，bsrⅰ内切酶能特异性识别kras基因c.35位密码子的野生型序列，并将其dna双链切断；而当c.35位密码子出现g>a、g>t、g>c突变时，bsrⅰ将不能识别该序列，不能将dna双链切断。通过在普通的pcr反应中，加入耐高温的限制性内切酶，可在反应过程中将野生型的dna片段破坏，使得野生型的pcr产物越来越少，而突变型的dna片段能在反应中不断的富集，提高了低丰度突变的检测灵敏性。总之，采用本发明所述检测kras基因突变的试剂盒和检测方法检测kras基因突变，可提高突变检测的灵敏度，减少样本使用量，有利用临床使用和推广。具体实施方式kras基因c.35g>a、c.35g>t、c.35g>c突变基因型转化(1)在样品模板中采用pcr方法扩增c.35突变位点待识别片段，引物如下：kras-f：5’-agacatcgtaggtagtgacaaagctttgactgcatacaaacttgtggtagttggac-3’(seqidno.1)kras-r：5’-caatatgttcctgcggtaaagcgtcaggatccttagaccatattcgtccaca-3’(seqidno.2)。(2)限制性内切酶bsrⅰ识别位点pcr反应条件：1)pcr体系如表1：表1hotstartaqplusdna0.3μl10xpcrbuffer2.5μldntp(各10mm)0.5μl上游引物(10μm)0.4μl下游引物(10μm)0.4μldna模板2μlddh2oupto25μl反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles；2)在pcr反应体系中加入限制性内切酶bsrⅰ0.8μl,65℃1小时3)95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5分钟。(3)pcr产物送去一代测序，测序结果与genebank中记录的序列做blast一致性分析。结果显示，当野生型模板与突变型模板的比例为10000:1的情况下，测序结果依然能够在kras基因c.35位置处出现一个套峰，结果显示该方法能够在大量野生型模板的干扰下成功扩增出微量丰度的突变型模板。sequencelisting<110>郴州市第一人民医院<120>一种检测血浆游离dna中kras基因突变的试剂盒及方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>56<212>dna<213>人工合成<400>1agacatcgtaggtagtgacaaagctttgactgcatacaaacttgtggtagttggac56<210>2<211>52<212>dna<213>人工合成<400>2caatatgttcctgcggtaaagcgtcaggatccttagaccatattcgtccaca52当前第1页12