血浆游离DNA双分子标记、标记和检测血浆cfNDA的方法及其用图
【技术领域】
[00011本发明涉及一种血浆游离DNA双分子标记、对血浆cfNDA进行标记的方法及其用 途，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 血浆中有不含细胞结构的游离脱氧核糖核酸，被称为无细胞脱氧核糖核酸(cell free DNA,cfDNA)[Chan KC,Yeung Sff,Lui WB,RainerTH,L0 YM.Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.Clin Chem.2005 Apn51(4):781-4：LcfDNA是一个复杂的混合体，大部分来自于血液中破裂的血 细胞或者血管内皮细胞，也有少部分来自于凋亡的胎盘细胞或者坏死的肿瘤细胞。通过检 测cfDNA中少量的胎盘DNA或者肿瘤DNA，就可以不侵入胚胎和不获取肿瘤活检组织的情况 下检测胚胎和肿瘤的遗传特征【Lo，Y.M.，Corbetta，N.，Chamberlain，P.F.，et al · (1997) Presence offetal DNA inmaternal plasma and serum.Lancet 350，485-487·AND Ignatiadis M，Lee M,Jeffrey SS.Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA:Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.Clin Cancer Res.2015 Nov 1;21(21):4786-800】，即俗称的非侵入性胎儿或肿瘤基因检测。
[0003] 基因检测的手段很多，高通量测序(next generation sequencing，NGS)就是有效 的手段之一。NGS能够在单次反应中，检测上亿条cfDNA的碱基排列顺序，功能十分强大，从 而使其成为非侵入性胎儿或肿瘤基因检测的重要技术手段之一。
[0004] 然而，NGS技术并不是完美的，它在检测的过程中会出现一定比例的测序错误。此 外，它在检测的起始样本量较低的DNA时，会导致一定的偏差，影响检测的准确性和稳定性。 这两个缺陷对非侵入性胎儿或肿瘤基因检测中的影响非常大。因为血液中cfDNA的含量很 低，并且来自胎盘或者肿瘤只占小部分。当胎儿或者肿瘤基因变异的比例和NGS测序错误的 比例类似时，就无法准确判断检测结果是真实的基因变异还是测序错误。
[0005] 分子标记技术被开发和应用于NGS项目上，在检测基因组DNA和转录组RNA上，均能 有效降低NGS检测中引入的偏差和错误【Schmitt MW，Kennedy SR，Salk JJ，Fox EJ，Hiatt JB，Loeb LA Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Sep 4 ； 109(36): 14508-13 AND Shiroguchi KIJia TZ,Sims PA,Xie XS Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Jan 24;109(4):1347-52.】〇
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种血浆游离DNA双分子标记、对 血浆cfNDA进行标记的方法及其用途。
[0007] 本发明的血浆游离DNA双分子标记，为寡核苷酸，序列如下：
[0008] a)5 ' P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
[0009] b)5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
[0010] 寡核苷酸排列从左到右为5'端到3'端，N代表随机碱基，P代表磷酸基团；寡核苷酸 序列通过人工合成。
[0011]采用血浆游离DNA双分子标记标记和检测血浆cfNDA的方法，包括如下步骤：用双 分子标记寡核苷酸对血浆rfNDA进行标记，将双分子标记寡核苷酸插入血浆rfNDA中，然后 对标记后的血浆cfNDA进行PCR扩增，再使用寡核苷酸E进行测序；
[0012] 所述的双分子标记寡核苷酸的PCR扩增引物为寡核苷酸D1和D2，D1和D2的核苷酸 序列如下：
[0013] D1 5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0014] D2 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
[0015] 寡核苷酸E的核苷酸序列如下：
[0016] 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0017]上述寡核苷酸D1、D2和E的排列从左到右为5 '端到3 '端;寡核苷酸序列通过人工合 成。
[0018] 所述的血衆cfNDA通过如下步骤进行制备：1)血衆制备;2)血衆cfDNA提取。
[0019] 所述的血浆cfNDA经过预处理再进行标记。
[0020] 所述的血浆制备的具体步骤如下：
[0021 ] 1)使用5-10ml经过抗凝和防溶血处理的血液，在4摄氏度下，1600g的转速，离心5 分钟，离心后血液会分层，取最上层液体于新的离心管中；
[0022] 2)在4摄氏度下，15000g的转速，离心15分钟，取上部液体于新的离心管中，血浆制 备完成。
[0023]所述的血浆cfDNA提取的具体步骤如下：
[0024] 1)按1:10的比例加入裂解液，在60摄氏度下，温浴20分钟；
[0025] 2)冷却到室温后，加入DNA捕获磁珠，在磁力架上静置5分钟，弃上清；
[0026] 3)用80%的酒精，清洗磁珠2次；
[0027] 4)用洗脱液将cfDNA从磁珠上洗脱。
[0028]所述的预处理的具体步骤如下：
[0029] 1)以50ul体系计，取提取好的cfDNA 40ul，加入5ul的缓冲液A1和5ul的酶A2,在 PCR仪器上按照如下程序进行温浴：
[0030]
[0031]^2)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物;
[0032] 3)以50ul体系计，取32ul纯化好的cfDNA产物，加入5ul缓冲液Bl、10ul 10mM dATP 和3ul酶B2，在PCR仪器上按照如下程序进行温浴：
[0033]
[0034] 4)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物；
[0035] 其中，
[0036] 所述的缓冲液A1 成分为：400mM 25°C、pH 7.8的Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT,10mM ATP,4mM dNTP；
[0037] 所述的酶A2为:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶；
[0038] 所述的缓冲液B1 成分为：500mM NaCl，100mM MgCl2，10mM DTT，100mM 25°C、pH 7.^9Tris-HCl;
[0039] 所述的酶B2为:Klenow片段。
[0040] 所述的标记和检测的具体步骤如下：
[0041 ] 1)取22ul纯化好的cfDNA预处理产物，加入25ul缓冲液Cl、2ul标记分子寡核苷酸 和lul酶C2，在PCR仪器上按照如下程序进行温浴： 「00421
[0043] 2)在上述反应产物中加入50ul缓冲液D、lul寡核苷酸Dl、lul寡核苷酸D2和lul酶 D3，在PCR仪器上按照如下程序进行温浴：
[0044]
[0045] 3)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物；
[0046] 4)按照NGS测序平台要求，进行上机前处理，使用寡核苷酸E进行测序，
[0047] 其中，
[0048] 所述的缓冲液C1成分为：100mM 25°C、pH 7.5的Tris-HCl，20mM MgCl2,2mM ATP， 20mM DTT；
[0049] 所述的酶C2为:T4DNA链接酶；
[0050] 所述的缓冲液D成分为：200mM 25°C、pH 8.5的Tris-HCl，luM KCl，3mM MgCl2;
[00511所述的酶D3为:高保真DNA聚合酶。
[0052] 本发明的血浆游离DNA双分子标记通过给每一个血浆游离DNA分子加上一个唯一 的分子标记，区分各个血浆游离DNA分子，可应用于血浆游离DNA检测。
[0053]本发明的血浆游离DNA双分子标记，避免了现有NGS技术检测cfDNA的缺陷，具体来 说，包括如下技术效果：
[0054] 1)增加了建库过程cfDNA有效数据量；
[0055] 2)降低了检测中间步骤产生的噪音信号(例如偏差和检测错误）；
[0056] 2)能有效检测出目标变异，同时具有很低的假阳性率，提高了基因检测的准确性 和稳定性。
【附图说明】
[0057]图1为传统方法和本发明方法构建的NGS测序文库胶图。
[0058]图2为传统方法和本发明方法检测样品中变异cfDNA的比例。
【具体实施方式】
[0059]本发明中，所涉及的成分如下：
[0060] 1)缓冲液A1 成分为：400mM 25°C、pH 7.8的Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT， 10mM ATP,4mM dNTP；
[0061 ] 2)酶A2为:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶；
[0062] 3)缓冲液B1 成分为：500mM NaCl，100mM MgCl2，10mM DTT，100mM 25°C、pH 7.9的 Tris-HCl；
[0063] 4)酶 B2 为：Klenow 片段。
[0064] 5)双分子标记寡核苷酸序列:寡核苷酸排列从左到右为5'端到3'端，N代表随机碱 基，P代表磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。
[0065] 5 ' P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
[0066] 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
[0067] 6)缓冲液C1 成分为：100mM 25°C、pH 7.5的Tris-HCl，20mM MgCh，2mM ATP，20mM DTT；
[0068] 7)酶C2 为：T4DNA 链接酶；
[0069] 8)缓冲液D成分为：200mM 25°C、pH 8.5的Tris-HCl，luM KCl，3mM MgCl2;
[0070] 9)酶D3为:高保真DNA聚合酶。
[0071] 10)寡核苷酸引物D1和D2:寡核苷酸排列从左到右为5 '端到3 '端;寡核苷酸序列通 过人工合成。
[0072] D1 5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0073] D2 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
[0074] 11)寡核苷酸E:寡核苷酸排列从左到右为5'端到3'端;寡核苷酸序列通过人工合 成。