[0075] 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [0076] 实施例1
[0077]本实施例的血浆游离DNA双分子标记，其寡核苷酸序列如上述序号5所述的分子标 记寡核苷酸序列，具体如下:寡核苷酸排列从左到右为5 '端到3 '端，N代表随机碱基，P代表 磷酸基团;寡核苷酸序列通过人工合成。
[0078] a)5 ' P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
[0079] b)5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
[0080] 采用本实施例的双分子标记对血浆cfNDA进行标记和检测的过程，包括如下步骤：
[0081] 1、血浆制备
[0082 ] 1)使用5-10ml经过抗凝和防溶血处理的血液，在4摄氏度下，1600g的转速，离心5 分钟，离心后血液会分层，取最上层液体于新的离心管中；
[0083] 2)在4摄氏度下，15000g的转速，离心15分钟，取上部液体于新的离心管中，血浆制 备完成。
[0084] 2、血浆 cfDNA 提取
[0085] 1)按1:10的比例加入裂解液，在60摄氏度下，温浴20分钟；
[0086] 2)冷却到室温后，加入DNA捕获磁珠，在磁力架上静置5分钟，弃上清；
[0087] 3)用80%的酒精，清洗磁珠2次；
[0088] 4)用洗脱液将cfDNA从磁珠上洗脱。
[0089] 3、血浆cfDNA预处理
[0090] 1)取提取好的cfDNA 40ul，加入5ul的缓冲液A1和5ul的酶A2,在PCR仪器上按照如 下程序进行温浴。
[0091]
'[0092]~2)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的1产物。 '
[0093] 3)取32ul纯化好的cfDNA产物，加入5ul缓冲液Bl、10ul 10mM dATP和3ul酶B2,在 PCR仪器上按照如下程序进行温浴。
[0094]
'[0095]~4)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的1产物。 '
[0096] 4、寡核苷酸双分子标记
[0097] 1)取22ul纯化好的cfDNA预处理产物，加入25ul缓冲液Cl、2ul双分子标记寡核苷 酸和lul酶C2,在PCR仪器上按照如下程序进行温浴。 rnn9Ri
[0099] 2)在上述反应产物中加入50ul缓冲液D、lul寡核苷酸Dl、lul寡核苷酸D2和lul酶 D3，在PCR仪器上按照如下程序进行温浴：
[0100]
[0101 ] 3)使用磁秌现性純化枉純化丽步的广物。
[0102] 4)按照NGS测序平台要求，进行上机前处理，使用寡核苷酸E进行测序。
[0103] 5、结果和结论
[0104] 1)使用本发明方法构建的NGS文库和传统方法的文库在浓度和主要片段大小结果 如图1所示，可以看出，在浓度和片段大小的范围上没有显著的差异，均符合NGS的要求。
[0105] 2)使用传统方法和本发明方法，构建NGS测序文库；然后通过常规基因捕获流程， 捕获149个基因的编码区域(编码区域约占1M个碱基）；通过NGS对3个样本进行测序，每个样 本约4千万有效比对的测序片段。传统方法中，有超过60%的测序片段由于其比对到染色体 上的相同位置，从而被判定为来源于同一 cfDNA分子，并认为其为建库过程中的产生的重 复，为无效数据，在数据分析时需去除。本发明方法，给每个cfDNA进行分子标记后显示，在 比对到染色体相同位置的测序片段有将近半数具有不同的分子标记，增加了有效数据量 读1)。
[0106] 表1重复片段(无效数据）占总数据的比例(括号内为标准差）
[0107]
[0108] 3)将正常的cfDNA和含有NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G突变的cfDNA按照不同比 例混合，得到突变占比15 %、30 %、50 %、65 %和80 %的样本。使用传统方法和本发明方法， 构建NGS测序文库;然后通过常规基因捕获流程，捕获149个基因的编码区域(编码区域约占 1M个碱基，包含EGFR基因外显子区域），去除无效数据后，用有效测序片段来计算突变的 cfDNA所占的比率。本方法的结果比传统方法更接近混合的比例（见图2 )，本方法比传统方 法的检测结果跟接近于预期值，尤其在某一 cfDNA组分(正常的或者突变的）含量较低时，本 方法的检测结果与混合比例值的偏离小于传统方法。
[0109] 4)在正常的cfDNA中加入含有NM_005228.3(EGFR): c. 2573T>G突变的cfDNA。突变 所占比例通过数字PCR确定为0.1 %。分别采用常规的NGS测序流程和本发明的测序流程进 行测序检测。平均测序深度为10000X的条件下，进行3次测序检测。在检测到NM_005228.3 (EGFR):c.2573T>G突变的同时，还检测到了一系列的测序错误(见表2)。
[0110] 表2基因突变测序覆盖次数(括号内为标准差）
[0111]
[0112] 仅随机选择了三个测序错误，其余测序错误未在此表列出。c.3166G>T在传统方法 的第1次检测中出现，c. 4161 de 1A在传统方法的第1次和第3次检测中出现，c. 5034de 1C在传 统方法的第2次和第3次检测中出现。因为测序错误并不是在每次测序中都存在，所以没有 计算其标准差。
[0113] 由表2可见，本发明的检测结果更加接近于预期结果，而传统方法的结果与预期结 果偏离较本发明的结果大。此外，传统方法有较高的假阳性率，在单次检测中，无法有效排 除假阳性结果对目标变异检测的干扰，从而无法判断检测到的匪_〇〇5228.3(EGFR): c.2573T>G变异是被检测样本中存在真实的基因变异，还是检测过程中的测序错误。虽然增 加检测次数，可以提高传统检测方法的准确性，但是显著增加了检测成本。本发明的在有效 检测出目标变异的同时，具有很低的假阳性率，使得在单次检测中准确做出判断。
【主权项】
1. 血浆游离DNA双分子标记，其特征在于，所述的双分子标记为寡核苷酸，序列如下： a) 5 ' P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG b) 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT 寡核苷酸排列从左到右为5 '端到3 '端，N代表随机碱基，P代表磷酸基团；寡核苷酸序列 通过人工合成。2. 采用如权利要求1所述的血浆游离DNA双分子标记标记和检测血浆CfNDA的方法，其 特征在于，包括如下步骤：用双分子标记寡核苷酸对血浆cfNDA进行标记，将双分子标记寡 核苷酸插入血浆cfNDA中，然后对标记后的血浆cfNDA进行PCR扩增，再使用寡核苷酸E进行 测序； 所述的双分子标记寡核苷酸的PCR扩增引物为寡核苷酸Dl和D2，D1和D2的核苷酸序列 如下： D15 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT D25 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT 寡核苷酸E的核苷酸序列如下： 5. ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 上述寡核苷酸Dl、D2和E的排列从左到右为5'端到3'端;寡核苷酸序列通过人工合成。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的血浆cf NDA通过如下步骤进行制备： 1)血浆制备;2)血浆cf DNA提取。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的血浆cf NDA经过预处理再进行标 记。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的血浆制备的具体步骤如下： 1) 使用5-10ml经过抗凝和防溶血处理的血液，在4摄氏度下，1600g的转速，离心5分钟， 离心后血液会分层，取最上层液体于新的离心管中； 2) 在4摄氏度下，15000g的转速，离心15分钟，取上部液体于新的离心管中，血浆制备完 成。6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的血浆cf DNA提取的具体步骤如下： 1) 按1:10的比例加入裂解液，在60摄氏度下，温浴20分钟； 2) 冷却到室温后，加入DNA捕获磁珠，在磁力架上静置5分钟，弃上清； 3) 用80 %的酒精，清洗磁珠2次； 4) 用洗脱液将cf DNA从磁珠上洗脱。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的预处理的具体步骤如下： 1) 以50ul体系计，取提取好的cfDNA 40ul，加入5ul的缓冲液Al和5ul的酶A2，在PCR仪 器上按照如下程序进行温浴：2) 使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物； 3) 以5〇111体系计，取32111纯化好的〇€0财产物，加入5111缓冲液81、1〇1111〇111]\1(^了？和 3ul酶B2，在PCR仪器上按照如下程序进行温浴：4)使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物； 其中， 所述的缓冲液Al成分为：400mM 25°C、pH 7.8的Tris-HCl ,IOOmM MgCl2JOOmM DTT， IOmM ATP，4mM dNTP; 所述的酶A2为:T4DNA聚合酶、Kl enow酶或T4多聚核苷酸激酶； 所述的缓冲液Bl成分为：500mM NaCl，IOOmM MgCl2，IOmM DTT，IOOmM 25°C、pH 7.9的 Tris-HCl； 所述的酶B2为:Klenow片段。8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的标记和检测的具体步骤如下： 1) 取22ul纯化好的cfDNA预处理产物，加入25ul缓冲液Cl、2ul标记分子寡核苷酸和Iul 酶C2，在PCR仪器上按照如下程序进行温浴：2) 在上述反应产物中加入50ul缓冲液D、Iul寡核苷酸Dl、Iul寡核苷酸D2和Iul酶D3，在 PCR仪器上按照如下程序进行温浴：3) 使用磁珠或硅基质纯化柱纯化前步的产物； 4) 按照NGS测序平台要求，进行上机前处理，使用寡核苷酸E进行测序， 其中， 所述的缓冲液Cl成分为：IOOmM 25°C、pH 7.5的Tris-HCl，20mM MgCl2，2mM ATP，20mM DTT ； 所述的酶C2为:T4DNA链接酶； 所述的缓冲液D成分为:200mM 25°C、pH 8.5的Tris-HCl，IuM KCl，3mM MgCl2; 所述的酶D3为:高保真DNA聚合酶。9. 如权利要求1所述的血浆游离DNA双分子标记具有应用于血浆游离DNA检测的用途。
【专利摘要】本发明提供了血浆游离DNA双分子标记，所述的双分子标记为寡核苷酸，序列如下：a)5’P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGb)5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT寡核苷酸排列从左到右为5’端到3’端，N代表随机碱基，P代表磷酸基团；寡核苷酸序列通过人工合成。本发明的血浆游离DNA双分子标记具有通过给每一个血浆游离DNA分子加上一个唯一的分子标记并区分各个血浆游离DNA分子，可应用于血浆游离DNA检测。本发明的血浆游离DNA双分子标记，避免了现有NGS技术检测cfDNA的缺陷，具体来说，包括如下技术效果：1)增加了建库过程cfDNA有效数据量；2)能降低基因检测中间步骤产生的噪音信号(例如偏差和检测错误)；3)能有效检测出目标变异，同时具有很低的假阳性率，提高了基因检测的准确性和稳定性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105483267
【申请号】CN201610029508
【发明人】古博
【申请人】古博
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月15日