专利名称：用于检测牛cd18基因d128g突变的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测牛⑶18基因D128G突变的引 物和特异性的TaqMan MGB探针。
背景技术：
牛白细胞粘附缺陷病(BovineLeukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)是一种先 天性免疫缺陷病，呈常染色体隐性遗传。致病的分子遗传机制是牛1号染色体(BTAl)上的 CD18基因编码区第383位的碱基发生A — G突变，导致位于该基因高度保守区的第128位 氨基酸由天门冬氨酸变为甘氨酸(D128G)，致使白细胞表面的B2整合素表达明显减少，进 而导致中性粒细胞不能黏附到血管壁而到达炎症部位发挥清除病原作用，使机体出现严重 的重复感染。BLAD患病牛以重复性感染和噬中性粒细胞增多为典型临床症状。BLAD犊牛易受 一系列细菌和真菌感染，多种组织器官的损伤均可能会发生，如口腔大面积溃疡、坏死性口 腔炎和牙周炎、牙齿脱落、牙槽骨膜炎、大面积脚癣等，此外还发现有多病灶的慢性溃疡坏 死性肠炎、鼻炎、化脓性支气管炎。患牛出生后，生长发育极差，其中绝大多数将会在2年内 死亡，且无繁殖和哺育能力。BLAD病例早在1983年即被发现，1992其分子机制被揭示并建立了基于PCR-RFLP 技术的分子检测方法。在欧美奶业发达国家的荷斯坦牛育种中，均严格监控和筛查牛群的 BLAD基因携带者，种牛系谱信息中需标注BLAD的基因型，配种时避免出现携带者之间的交 配，不断淘汰BLAD携带者种公牛，从而逐步降低牛群中BLAD基因频率。近年来，我国大量地从国外进口种牛、胚胎和冷冻精液，一方面充分利用了国际上 优秀种质资源，有利于提高我国奶牛的遗传改良进展，但另一方面，也增加了遗传缺陷在我 国范围内快速传播的风险，因此需要建立起重要遗传缺陷的检测方法，严格控制遗传缺陷 的发生。最近国内研究人员在我国荷斯坦牛中也检测到BLAD携带者，警示我国奶牛育种 中亟待开展BLAD筛查，在种公牛中淘汰携带者，从而降低该遗传缺陷对我国牛群的威胁。 借助分子检测方法确定公牛D128G突变的基因型，在种公牛中逐渐淘汰BLAD携带者，是降 低BLAD遗传缺陷基因频率的有效措施。由于⑶18基因D128G突变位点可以被限制性内切酶TaqI识别，因此检测该位点 通常都采用PCR-RFLP技术。该技术将PCR与RFLP相结合，是一种常用的单核苷酸突变 (SNP)检测方法。基本原理是，在SNP位点两侧先设计一对特异引物，使用PCR技术特异性 扩增包含突变位点的DNA片段，再利用SNP位点的不同等位基因导致增加一个酶切位点或 使酶切位点消失的特性，将扩增产物用特异的限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳检 测，即可根据酶切产条带判定基因型。检测过程需要3个步骤①利用聚合酶链式反应扩增 目的片段；②扩增产物的限制性内切酶消化；③酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测。可以看 出，该方法需要3个步骤才能获得基因型，因此存在步骤繁琐，耗时长，灵敏度低、检测结果易受实验条件的影响等缺点。基于实时荧光定量PCR的单核苷酸多态性(SNP)检测，是由美国ABI公司研发的 SNP等位基因分型技术，是利用DNA聚合酶的5' -3'核酸酶外切功能来水解探针，通过探 针报告基团发出的荧光来检测PCR产物的基因型。等位基因分型需要两条探针(TaqMan探 针)和一对引物，一条探针对应一个等位基因，每条探针在5'和3'各有一个含有荧光的 报告基团和淬灭基团。当探针完整时，由于报告基团距离淬灭基团很近，报告基团的荧光能 量被淬灭基团吸收。在PCR进行过程中，正反向引物在DNA聚合酶的引导下合成一个特定分 子DNA，探针可以和目的DNA杂交，DNA聚合酶的5' -3'核酸酶外切功能可以水解这个杂 合分子，这样探针被水解后，5'和3'的报告基团和淬灭基团被分开，5'报告基团发出荧 光，根据荧光的颜色可以判定等位基因的基因型。PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行， 仪器每个PCR循环过程中收集一次荧光信号，随着PCR反应的进行荧光信号不断累积，根据 荧光信号的种类及信号强度，判定SNP基因型。TaqMan MGB探针是对传统TaqMan探针的改 进，其优点是3'端的淬灭基团是不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，因 此当淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰；此外，TaqMan MGB探针还具有更强的序列特异性，实验结果更精确可靠等优点。总之，TaqMan探针技术与 传统的SNP检测技术相比，速度快，灵敏度高，自动化程度高，而且经过一个PCR反应即可判 型，反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。
发明内容
本发明的目的是克服现有的采用聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态 (PCR-RFLP)方法检测BLAD遗传缺陷基因存在步骤繁琐，耗时长，灵敏度低、检测结果易受 实验条件的影响等缺点，提供一种能够准确高效地检测CD18基因D128G突变位点的合适引 物和特异性的TaqMan MGB探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快 速灵敏地检测待测牛CD18 D128G突变位点基因型，从而准确筛查BLAD遗传缺陷携带者。为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测牛⑶18基因D128G突变的引物和 探针，所述引物包括上游引物CD18-F :5，-GTTGCGTTCAACGTGACCTT-3，和下游引物CD18-R 5’ -GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTA-3’。上游引物由20个碱基组成，对应GenBank中牛CD18基因序列(Accession number :Y12672)的第1154 1173位碱基；下游引物由23个碱基组成，对应⑶18基因序 列的第1208 1230位碱基序列。该引物对的扩增片段长度为77bp。所述探针包括1)突变型等位基因探针 CD18-mutant :5，-FAM-CCCATCGGCCTGTAC-NFQ ；以及2)野生型等位基因探针 CD18-wild :5，-VIC-CCCCATCGACCTGTAC-NFQ。突变型等位基因的探针⑶18-mutant，由15个碱基组成，对应⑶18基因序列的第 1193 1207位碱基序列，针对突变碱基G (第128位氨基酸为甘氨酸G)，探针5’端连接了 荧光基团FAM ；野生型等位基因的探针⑶18-wild，由16个碱基组成，对应⑶18基因序列的 第1192 1207位碱基序列，针对野生型碱基A(第180位氨基酸为天门冬氨酸D)，探针5’ 端连接了荧光基团VIC。两个探针的3’端标均记有淬灭基团，该基团为不发光的淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher，NFQ)。
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本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。一种筛查牛白细胞粘附缺陷(BLAD)基因携带者的方法，包括以下步骤(1)提取待测牛的基因组DNA ；(2)采用实时荧光定量PCR技术，以待测牛的基因组DNA为模板，用上述引物对和 两条探针进行PCR扩增；(3)对步骤(2)的扩增产物进行基因型判定如果突变型等位基因探针所标记荧 光染料(FAM，其激发波长465nm，发射波长510nm)的荧光强度呈S型增长，而野生型等位基 因探针所标记荧光染料(VIC，其激发波长533nm，发射波长580nm)的荧光强度无S型增长， 表示被测样本基因型为GG;反之，如果野生型等位基因探针所标记荧光染料(VIC)的荧光 强度呈S型增长，而突变型等位基因探针所标记荧光染料(FAM)的荧光强度无S型增长，表 示被测样本基因型为AA ；如果两种荧光强度均呈S型增长，则被测样本基因型为AG。(4)最后可以通过专门的分析软件，进行等位基因分型。为了便于检测结果分析，可在PCR扩增步骤中增加已知基因型的阳性对照和阴性 对照。其中，突变纯合基因型(GG)阳性对照来自隐性纯合患病个体或者是突变型等位基因 的克隆子，野生型基因型(AA)阳性对照是已经过测序验证的样本，杂合型(AG)阳性对照是 经过DNA测序验证的样本。阴性对照不加任何模板DNA。另外，本发明还提供含有上述引物和特异性探针的用于检测牛CD18基因D128G突 变位点的试剂盒。本发明首次提供一种能够准确高效地检测牛⑶18基因D128G突变位点的引物和 特异性的TaqMan MGB探针，与传统的检测技术相比，具有以下优点(1)只经一个酶反应步骤，即可得出判型结果，无需PCR后反应。(2)具有通用的反应体系和条件，节省大量时间。(3)反应的整个过程在封闭的管中进行，减少了污染。(4)工作流程简单，只需混合模板、两种试剂即可进行仪器检测，易于掌握。(5) TaqMan探针方法对DNA的质量耐受性较高，这也反映了该方法灵敏度高。
图1为本发明实时荧光定量PCR仪对FAM荧光信号的检测结果。图2为本发明实时荧光定量PCR仪对VIC荧光信号的检测结果。图3为本发明5个被检测个体及1个阴性对照样品的荧光信号散点图，其中1，2， 3代表野生型纯合子，4，5代表携带者，6代表阴性对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1、DNA 提取(1)牛血液DNA提取采用天根生化生物技术公司DP318试剂盒从血块中提取基因组DNA，具体步骤如 下
1)取出样品，融化后，剪取200yL于2mL离心管中；2)加入600 μ L细胞裂解液CL，摇勻；3) IOOOOrpm离心lmin，弃去暗红色上清；4)重复 2)和 3) —次；5)加入200 μ L缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；6)加入20 μ L蛋白酶K，220 μ L缓冲液GB,充分晃动摇勻；7)56°C烘箱中消化3小时以上，消化早期，需颠倒混勻数次，直至溶液变澄清，无 血块颗粒；8)加入200 μ L无水乙醇，轻轻晃动混勻，转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃
去收集管中的暗绿色废液；9)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃去收集管中废液；10)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去废液；11)加入500 μ L漂洗液Pff, 12000rpm离心30s,弃去废液；12) 12000rpm 离心 2min ；13)将吸附柱转移到新的1. 5mL离心管中，开口凉干；14)加入100 μ L在64°C预热的洗脱缓冲液TB，静置2min ；15) 12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管中溶液中，4°C保存 备用或-20°C长期保存。(2)公牛冻精DNA提取1)将细管冻精(0. 25mL)转移到2mL离心管中，加入500 μ L生理盐水，涡旋离心，
弃废液保留沉淀，重复以上操作一次；2)向沉淀中加入400yL冻精裂解液(含0ΤΤ)、100μ 20%的SDS，涡旋，最后加入 10 μ L的蛋白酶K(储液浓度20mg/mL)，充分混勻，56°C消化4h或过夜；3)消化结束，加入300 μ L饱和食盐水，颠倒混勻，低温离心，去除蛋白质杂质，将 上清液转管保留，并加入1000 μ L冰乙醇，轻轻颠倒混勻至絮状沉淀不再增加，再离心，此 时弃去上清液，所得的沉淀即DNA，用500 μ L75%乙醇洗涤2次，晾置几分钟使酒精挥发，最 后加适量TE缓冲液溶解，-20°C保存。2、PCR 扩增PCR反应体系基因组DNA l_20ng，上、下游引物浓度各900nM和探针浓度各 200nM，IX TaciMan 通用 PCR 扩增预混试剂(TaqMan Universal PCR Master Mix，购自 美国应用生物系统公司)。其中，上游引物为CD18-F :5，-GTTGCGTTCAACGTGACCTT-3，和下游引 物为CD18-R :5，-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTA-3’。探针为突变型等位基因探针 CD18-mutant :5，-FAM-CCCATCGGCCTGTAC-NFQ，以及野生型等位基因探针 CD18_wild 5’ -VIC-CCCCATCGACCTGTAC-NFQ。PCR反应条件:95 V，预变性IOmin ；95°C变性15s，60°C退火/延伸lmin,共50个循环。仪器罗氏LightCyCler, 480型实时荧光定量PCR仪。3、结果分析
在实时荧光定量PCR仪中，实时检测整个扩增中两种荧光的强度。反应结束后， 再用罗氏Endpoint Genotyping analysis软件分析结果。图1是实时荧光定量PCR仪对 FAM荧光信号(激发波长465nm，发射波长510nm)的检测结果，反映突变型等位基因(CD18 128G)的扩增情况，每一条曲线代表一个样本，CD18 D128G突变的携带者出现典型的S形扩 增曲线，而野生型纯合子出现较低的递增曲线，阴性对照样品的荧光信号接近O。图2是实 时荧光定量PCR仪对VIC荧光信号(激发波长533nm，发射波长580nm)的检测结果，反映野 生型等位基因(⑶18 128D)的扩增情况，每一条曲线代表一个样本，野生型纯合子和⑶18 D128G突变携带者都出现典型的S形扩增曲线，而阴性对照的荧光信号接近O。图3是所分 析的5个被检测个体及1个阴性对照荧光信号的散点图，从中可以直观地区分个体基因型， 其中样品编号4，5代表携带者，样品编号1，2，3代表野生型纯合子，样品编号6代表阴性对 照。所有检测样品均进行DNA测序验证，测序结果与本发明方法所检测结果一致，在 突变位点上野生型样品的基因型为AA，携带者为杂合型AG，证明本发明提供的技术方法检 测结果准确可靠。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.用于检测牛⑶18基因D128G突变的引物和探针，所述引物包括上游引物⑶18-F 5，-GTTGCGTTCAACGTGACCTT-3，和下游引物 CD18-R :5，-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTA-3，；所 述探针包括1)突变型等位基因探针CD18-mutant :5，-FAM-CCCATCGGCCT GTAC-NFQ ；以及2)野生型等位基因探针CD18-wild :5，-VIC-CCCCATCGACCTG TAC-NFQ。
2.含有权利要求1所述的引物和探针检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种能够准确高效地检测CD18基因D128G突变位点的引物和特异性的TaqMan MGB探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测牛CD18 D128G突变位点基因型，从而准确筛查BLAD遗传缺陷携带者。与传统的检测技术相比具有诸多优点，包括检测速度快，灵敏度高，自动化程度高，而且经过一个PCR反应即可判型，反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。
文档编号C12N15/11GK102002527SQ20101054754
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者俞英, 孙东晓, 张毅, 张沅, 张胜利, 王雅春, 范学华 申请人:中国农业大学