专利名称：一种可酸切高拷贝降血压肽串联基因的构建、表达及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体的涉及制备高拷贝数降血压肽 Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp
-Gly-Asp串联DNA，利用其表达载体制备所述重组多肽的方法，和所述的重组多肽的医学用途。
背景技术：
原发性高血压是由多种发病因素和复杂的发病机制引起的，其中包括遗传、饮食习惯、精神状态等，目前在治疗高血压药物的研究中，降血压肽的研究已成为热点。降血压肽是一种血管紧张素酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，A(E)抑制剂，通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性，调节肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System, RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin System，KKS)(参见殷晓峰.等人，中国药理学通报，19 :971- 975 Q003)。)来起到降血压的作用。现在已陆续从多种动植物原料及下脚料中，如蝮蛇蛇毒、沙丁鱼、乳酪、大豆豆粕、 发酵豆奶、玉米渣胶、原蛋白(参见黄家音.等人，食品与发酵工业，32 :81-86 (2006)。)等分离出了多种具有降血压功能的活性多肽，因其降血压效果明显、安全无毒副作用，已成为活性肽研究的热点。降血压肽Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp是一种从金枪鱼科鱼肉水解物 (参见Kohama，Y.等人，AgricBiol Chem.，55 :2169-2170 (1991) ;Fida Hasan.等人， Biochemistry, 41 =505-511 (2006) )分离得到的活性肽，IC5tl值为0. 9 μ M左右，但是从鱼肉水解物分离此活性肽步骤繁琐，产量低，目前尚未有适合工业生产的分离方法。目前生物技术的发展为生产降血压肽提供了一种新的方法，但降血压肽由于一般都是几个氨基酸组成的短肽，而要实现短肽直接在宿主菌中的表达并分离出来非常困难， 而采取融合表达方式也因采用较大的融合标签和较低降血压基因拷贝导致表达产量很低。 (参见张丽君.等人，中国生化药物杂志，27(1) 19-21 (2006)。)
因此构建含有具有合适高拷贝数的基因，并采用较小的融合标签来融合表达该基因对实现该降血压肽的高效表达和工业化生产有着重要意义。
发明内容
在本发明的第一方面提供了构建可酸切降血压肽串联的方法。将降血压肽首尾线性串联，多肽的连接位点为甲酸裂解肽键专一性位点，可在甲酸作用下重新裂解成降血压肽单体。在本发明的第二方面提供了将降血压肽DNA单元串联成高拷贝数的方法，利用设计在降血压肽DNA单元两端的同尾酶位点反复酶切连接构建成高拷贝数串联DNA。在本发明的第三方面，提供按照上述方法构建高拷贝降血压肽串联DNA，该基因具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列。
在本发明的第四方面提供含有上述降血压肽串联DNA的表达载体pET30a_32PD。在本发明的第五方面提供利用上述载体转化的重组大肠杆菌。该菌种于2010年 8月19日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为大肠杆菌fedaridai coli BL21-M32PD CCTCC NO: M 2010205。本发明的优点是利用pET_30a上较小的His标签片断(4kDa左右)融合表达串联 32次目的多肽(Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp)，使多肽的分子量达到了 ^kDa左右 (总重组蛋白分子量30kDa左右)，增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加了表达效率和减小了小肽的分离难度。
其中图1为本发明多拷贝基因构建示意图； 图2为含不同拷贝基因质粒载体PCR电泳图； 图3为不同拷贝基因质粒载体双酶切电泳图； 图4为重组质粒PET30a-32PD双酶切电泳图5为本发明的BL21-M32PD工程菌诱导表达电泳图，其中注1、蛋白质Marker ； 2 含 PET-32PD 的 BL21 菌株(未诱导)3:含 PET-32PD 的 BL21 菌株(IPTG 诱导)；4:含 PET-32P 的BL21菌株(IPTG诱导)超声破碎沉淀5:含PET-32PD的BL21菌株(IPTG诱导)超声
破碎上清。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例1可酸切降血压肽Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp串联多肽单元设计
本发明设计的降血压肽Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp的N端为Pro、 C端为Asp。Asp-Pro序列为甲酸的特异性切割位点，在70%的甲酸作用下Asp-Pro 序列之间的肽键会专一性断裂，为获得合适大小的DNA序列，故先将降血压肽 Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp 首尾串联 4 次，为 Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp -Pro-Thr-His_I1e-Lys-Trp-Gly-Asp-Pro-Thr-His_I1e-Lys-Trp-Gly-Asp-Pro-Thr-His_ Ile-Lys-Trp-Gly-Asp (SEQ ID N03)。实施例2可酸切降血压肽Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp串联DNA单元设计 1、为了获得降血压肽Pro-Thr-His-IIe-Lys-Trp-Gly-Asp高拷贝数串联DNA，在串联
降血压肽(序列为SEQ ID N03)对应DNA两端添加汉3 H I和々§·_/ II同尾酶酶切位点，用于构建不同拷贝数串联DNA。BamA I和欲_7 II同尾酶酶切位点GGATCC和AGATCA对应的氨基酸分别为Gly-Ser和Argler，为了不引入额外氨基酸，将其读码框位移一位，补上核苷酸为 GGGGATCCG 和 GGAGATCAG，对应的氨基酸为 Gly-Asp-Pro 和 Gly-Asp-LeuJf Pro-Thr-Hi s-IIe-Lys-Trp-Gly-Asp-Pro-Thr-His-IIe-Lys-Trp-Gly-Asp-Pro-Thr-His-IIe-Lys-Trp -Gly-Asp-Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp 多肽序列调整成 Gly-Asp-Pro-Thr-His-Il e~Lys-Trp-Gly-Asp-Pro-Thr-His-IIe-Lys-Trp-Gly-Asp-Pro-Thr-His-IIe-Lys-Trp-Gly -Asp-Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp-Leu-Tyr (SEQ ID N04)。2、将步骤1所得多肽序列N端和C端的Gly-Asp-Pro和Gly-Asp-Leu-Tyr氨基酸序列翻译成核苷酸序列GGGGATCCG和GGAGATCAGTAT，其余按大肠杆菌密码子使用频率优化，核苷酸序列如SEQ ID NOl所示
GGGGATCCGACCCATATTAAATGGGGCGATCCGACCCACATCAAGTGGGGTGACCCGACGCATATTAAATGGG GCGATCCGACCCATATCAAATGGGGAGATCAGTAT (SEQ ID NO. 1)
3、然后在序列SEQ ID NOl的5'端添加々w I酶切位点、3'端添加历^i/ III酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID N02所示
GGTACCGGGGATCCGACCCATATTAAATGGGGCGATCCGACCCACATCAAGTGGGGTGACCCGACGCATATTA AATGGGGCGATCCGACCCATATCAAATGGGGAGATCTGTATAAGCTT(SEQ ID N02)
实施例3含降血压肽Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp高拷贝串联DNA重组载体的
构建
1、核苷酸序列SEQ ID N02由上海旭冠生物技术发展有限公司合成，克隆至pUC18 载体(购自Novagen公司)，插入的酶切位点为式Ot I和Hind III，将此重组载体命名为 PUC18-4PD。2、将所得 pUC18-4PD 利用 pUC18 通用引物 MlSI^rimerRV(CAGGAAACAGCTATGAC)和 M13M13PrimerM3 (GTAAAACGACGGCCAGT)(购自TaKaRa公司)进行PCR得目的片断，回收目的片断进行BawR I和Hind III双酶切(购自TaKaRa公司)双酶切。3、将pUC18-4PD载体进行Bgl II和Hind III双酶切(购自TaKafei公司)回收载体大片断。4、由于I和ife·/ II是同尾酶，利用T4连接酶将步骤2回收的目的片断和步骤3回收载体大片断连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli )DH5 α，进行菌落PCR，筛选阳性克隆，培养阳性克隆，提取质粒进行汉I和历III双酶切(购自TaKaRa公司)鉴定， 获得含8次重复降血压肽DNA序列的质粒，命名为pUC18-8PD。5、将pUC18-8PD重复步骤2_4操作，获得含16次重复降血压肽DNA序列的质粒， 命名为PUC18-16PD。将pUC18-16PD继续以上步骤2_4可获得含32次重复降血压肽DNA序列的质粒，命名为PUC18-32PD。6、将含有pUC18-32PD质粒的DH5 α菌株送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与设计的一致。(以上的操作如图1所示，所获得的质粒的PCR和I和历^iZIII 双酶切电泳结果如图2和3所示。)
7、将由以上操作所得的含有32次重复的质粒pUC18-32PD进行式ot I和历'/^III(购自 TaKaRa公司)双酶切，回收750bp左右的目的片断。8、同时将pET30a载体(购自Novagen公司)进行同样的双酶切，回收大片断。9、利用T4连接酶将回收的目的片断与pET30a载体大片断相连，转化大肠杆菌DH5 α，进行菌落PCR，筛选阳性克隆，提取质粒进行式ot I和历iiZIII双酶切(购自TaKaRa公司)鉴定(如图4所示)，获得含32次重复降血压肽DNA序列的质粒，命名为pET30a-32PD。10、将含有PET30a_32PD质粒的DH5a菌株送至上海生物工程有限公司测序，测序结果与设计的一致。从含测序正确的DH5a菌株提取pET30a_32PD质粒，转化大肠杆菌 {Escherichia co/i)BL21，将所得菌株命名为BL21-M32PD，该菌种于2010年在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为fecAericAai coli BL21-M32PD CCTCC M 2010205。实施例3重组串联多肽的表达和检测
将实例2获得的大肠杆菌BL21-M32PD按体积比为1%接种量接种于50 mL含卡那霉素 Kan (50yg/ml)W LB 液体培养基(胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0) 中，37°C，200 r ^irT1恒温摇床培养至0D600为1. 5时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至终浓度1 mmol*L _ 1JSO诱导12 h,5000 r ^irT1离心收集菌体，将菌体反复冻溶3次，在PBS缓冲溶液(pH7. 0)进行超声破碎(300Wds/2s，2 min)，8000 r · mirT1离心取沉淀和上清，进行SDS-PAGE电泳，电泳图如图5所示。电泳表明在大肠杆菌诱导后目的蛋白主要存在于大肠杆菌超声破碎液离心后的沉淀中，重组蛋白的分子量大小为30 kDa 左右，与设计的分子量大小吻合。实施例4重组单体多肽制备纯化
将实施例3所述方法离心所得的沉淀溶于进行8ml上柱缓冲溶液，进行活化的Ni-柱 (Novagen，美国)纯化得到His标记的重组蛋白，将重组蛋白充分溶解于6M尿素中，加入两倍体积pH为8. 0的0. 1%的肠激酶溶液(购自Novagen公司)，37°C温浴8小时，进行活化的Ni-柱(购自Novagen公司)去除His标记融合标签，制得去融合标签的串联多肽，将所得到得的串联多肽溶液加入1倍体积的70%甲酸，50°C温浴12小时，CELLUFINE GH-25柱 (购自CHISSO公司)过滤层析所得纯化多肽，经二喹啉甲酸(BCA)法检测单体多肽的表达量为 0. 38g · L “ 1O实施例5重组单体多肽活性检测
活性检测所用多肽按照实施例3和实施例4方法制备。体外活性检测采用Vermeirssen等改进的以FAPGG为血管紧张素I模拟物的分光光度法，如表1，测得IC5tl值为1. 8 mg/L，具有很好的降血压效果，比文献报道的活性值(IC50 0. 86 mg/L)低(参见Kohama，Y.等人，AgricBiol Chem.，55 2169-2170 (1991)。)。表1 ACE抑制活性的测定
权利要求
1.一种可酸切串联降血压肽的构建方法，将降血压肽首尾线性串联，多肽的连接位点为甲酸裂解肽键专一性位点，可在甲酸作用下重新裂解成降血压肽单体。
2.将降血压肽DNA单元串联成高拷贝数的方法，利用设计在降血压肽DNA单元两端的同尾酶位点反复酶切连接构建成高拷贝数串联DNA。
3.根据权利要求2所述的方法构建的高拷贝降血压肽串联DNA，该基因具有如SEQID N02所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求3所述的降血压肽串联DNA的表达载体pET30a-32PD。
5.利用权利要求3所述的载体转化的重组大肠杆菌，保藏编号为fecAericAaicoli BL21-M32PD CCTCC NO: M 2010205。
全文摘要
本发明公开了一种可酸切高拷贝降血压肽串联基因的构建、表达及应用。提供了构建可酸切降血压肽串联的方法和将降血压肽DNA单元串联成高拷贝数的方法。同时提供按照上述方法构建高拷贝降血压肽串联DNA，该基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。还提供含有上述降血压肽串联DNA的表达载体pET30a-32PD及其转化的重组大肠杆菌。本发明利用pET-30a上较小的His标签片断(4kDa左右)融合表达串联32次的目的多肽，使多肽的分子量达到了26kDa左右(总重组蛋白分子量30kDa左右)，增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加了表达效率和减小了小肽的分离难度。
文档编号C12R1/19GK102167733SQ201010547009
公开日2011年8月31日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者任晓锋, 曲文娟, 李云亮, 马海乐, 黄六容 申请人:江苏大学