Braf基因突变的快速检测的制作方法

专利名称：Braf基因突变的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种BRAF基因突变的高灵敏快速检 测。
背景技术：
BRAF基因属于RAF家族成员，位于染色体7q34，大小为190Kb，含有七个转录区， 包括18个外显子，编码一个67KD-99KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的增殖、分化 和凋亡。BRAF基因可在甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中发生突 变。2002年Davie等在66%的恶性黑色素瘤和一系列的其它肿瘤中检测到BRAF基因体细 胞突变，该突变主要见于BRAF基因11和15外显子的激酶结构域内，80%以上的突变都是 15外显子1799位核苷酸上的单碱基颠换，致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。之 后，不同国家和地域的学者在甲状腺乳头状癌(papillarythyroid cancer, PTC)中检测到 了 BRAFv6°°e突变。由于该突变中在599位的苏氨酸活化性磷酸化位点附近插入了一个负性 调节残基，可模拟活化区域的磷酸化过程，使BRAF基因与维持其失活态的ATP结合环活化 区的联系中断，从而级联式激活，并通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信号传导通路而引起细胞 的异常增殖和分化，最终导致肿瘤的形成。B-Raf基因突变被发现存在于黑色素瘤、大肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中。本检测 试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患B-Raf基因突变情况。为临床医生用药提供指导和依 据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。检测BRAF基因突变，对判断肿瘤的发生和发展后以及了解肿瘤的治疗效果具有 一定意义。(1)正常人血检中出现BRAF基因异常，提示存在肿瘤易感性；(2)大量研究表明， 无BRAF基因突变的结直肠癌等肿瘤患者，经帕尼单抗和爱比妥靶向药物治疗疗效明显，因 此，通过检测BRAF基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患 者生存期。恶性肿瘤病人血浆或血清中存在高水平的循环DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细 胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变，表明这 是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究 的一个热点。目前，血浆突变检测可以作为肿瘤分子诊断的一种新方法。由于BRAF基因的突变对如甲状腺乳头状癌等肿瘤的相关性，所以检测BRAF的突 变基因对及早诊断和治疗癌症有很大的临床意义。本发明主要是利用高分辨率溶解曲线分 析来进行BRAF基因突变的高灵敏快速检测。本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRAF突变，协助临床医生实现肿 瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。目前普遍应用的BRAF基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP 法)和DNA直接测序法等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在 以下缺点RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序该方法存在以下缺点检 测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度 较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据， 需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法不适用于临床要求。临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免污染的BRAF基因突变检测技 术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性和高灵敏度的要求。

发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便和有效避免污染的检测BRAF基因 突变的试剂盒，解决了现有技术中进行BRAF基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、精确 度低和污染等问题，尤其提供了除组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测本发明提供的技术方案是一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特 异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子 BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述 BRAF 11具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No 2的连续核苷 酸序列。优选的，所述连续核苷酸序列所述连续核苷酸序列为SEQ ID No 3 20序列之一 的正向或反向核苷酸序列。优选的，所述引物为SEQ ID No 3 20序列之一的正向引物或反向引物。优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为 优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为 优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料，ResoLight染 料、SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混 合液；所述PCR缓冲液包括Tris *cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。本发明的另一目的在于一种检测BRAF基因外显子位点突变的方法，其特征在于 所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有BRAF基因的第十一外显子BRAF11或第十五外显子 BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRAF基因进行PCR 扩增；(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点检测。优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔 道的脱落物、病变组织中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上 扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶解曲线法的条件为92 97°C 变性lmin ；40°C复性lmin ；然后初始溶解温度60°C开始程序升温溶解至95°C，并在溶解过 程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。本发明的又一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的BRAF基因突 变检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和 肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。BRAF基因序列如SEQ ID No :21所示，所述的突变常发生在BRAF的第11个外显 子的突变和发生在BRAF的第15个外显子的突变
6 本发明提供了一种检测BRAF基因突变的试剂盒，适用于BRAF第11外显子G463、 G465、G468的突变和第15个外显子1799T > A的突变，所述的试剂盒包括以下试剂阴性 对照DNA、用于扩增样本DNA中BRAF基因的引物、用于扩增样本DNA中BRAF基因的PCR反 应试剂。较佳地，所述试剂盒还包含反应所需的buffer、dNTP、引物、荧光染料、MgCl2、Taq酶。所述的PCR引物，用化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端10-50个序列的模 板，以及与之配对的反向序列。所述的PCR引物，下表所示的引物对 所述的PCR引物，用于扩增BRAF基因靶序列，优选为下表所示的引物对，BRAF的 第 11 个外显子的序列 SEQ ID No 1 ；CGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGGGACA AAGAATTGGATCTGGATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTAAGTATGTAATGTGGTGACA ；BRAF 的第 15 个外显子的序列 SEQ ID No 2 ；TTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGAC CTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTo 所述的阴性对照DNA，用常规方法从正常人组织中提取获得的DNA。所述的正常人 组织，包括外周血、体液、腔道的脱落物，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgC12、Taq酶、 DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括三羟甲基氨基甲烷盐(Tris*Cl)，氯化钾，硫酸铵，氯化 镁；酸碱度(PH值)8. 0-9. 0 (20°C )。所述的PCR缓冲液，，包括10x缓冲液，终浓度15mM的 氯化镁，终 pH 8.7。所述的 dNTP 混合液，包括 10mMdATP、10mM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合液。所述的荧光染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、 SYT0 9 染料。所述的 MgCl2 为 10-30mM MgCl2。所述的 MgCl2 为 25mM MgCl2。所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/ min at 72 °C，存储缓冲液 10_40mM Tris cl，50_200mM 氯化钾(KCL)，0-5. OmM 二硫苏 糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2. 0 % (V/V)乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet)P-40,0-2. 0% (V/V)吐温 20 (Tween 20) ,30-70% (v/v)甘油(glycerol)，稳定 剂(stabilizer) :pH 7. 0-10. 0(20°C )所述的存储缓冲液，包括终浓度为20mM Tris cl、100mM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.0. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v) 稳定剂的终 pH值为9.0。所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。所述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、粪 便、病变组织、肿瘤组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。利用试剂盒进行检测时，包括PCR扩增和HRM程序，其反应条件(PCR反应条件和 HRM的条件)如下表所示 更为优选的， 最为优选的， 本发明在另一方面，提供了一种检测BRAF基因突变的方法，该方法是检测来自 于待测个体样本中的BRAF基因是否存在突变位点，其突变位置分别是第11外显子G463、 G465、G468点突变和第15外显子V600E (T1799A)点突变。其中，所述的检测方法包括如下步骤(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本(2)用上述试剂盒中的阴性DNA，引物及试剂，以第(1)步中提取的DNA为模板进 行实时荧光定量PCR(3) PCR反应条件及HRM条件见下表 进行数据分析，运行溶解曲线观察峰图是否呈光滑的单峰，再运行Genescan自动 分析，通过与阴性进行对比来判断样本是否发生了待检测的BRAF位点的突变。
所述的方法中，通过使用所述的试剂盒、DNA模板，按所述的反应条件在荧光定 量PCR仪上进行序列扩增、运行溶解曲线，进行数据分析，得到分型的图谱。所述的荧光定 量PCR仪，包括LightCyeler 480 (罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI7500 (美国应用生物系 统公司，纽约，美国)、ABI7900(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、QiagenRotor-Gene 6000 (德国Qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner (美国Idaho公司，爱达 荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入MIX，进行 PCR反应，配套的基因分型软件即可自动区分野生型与突变型。采用的阴性对照样品可以包 括BRAF-463和BRAF-1799阴性对照样品。本发明的试剂盒可以提供与肿瘤用药选择和诊断相关的BRAF基因突变的快速检 测，所述的肿瘤，包括胰腺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、急性白血病、结直肠癌、甲状腺乳头 状癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔 有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺 癌、淋巴细胞癌。较为优选的，所述的肿瘤包括胰腺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、急性白血 病、结直肠癌和甲状腺乳头状癌。检测BRAF基因突变的用于PCR反应的试剂盒，适用于BRAF第—^一外显子及第 十五外显子突变的检测。本发明检测BRAF基因突变时，所述引物用于扩增BRAF基因靶向 序列，包括以下引物对(1)第一引物序列含有BRAF-463的至少15个连续的核苷酸，第二 引物序列含有BRAF-463的至少15个连续的核苷酸；⑵第一引物序列含有BRAF-1799的 至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRAF-1799的至少15个连续的核苷酸。优选的，本发明的检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本(2)用上述的试剂盒和引物，以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板，进行实时 定量PCR检测(3)分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴 性对照参比，判断样本DNA中KRAS基因的各位点是否突变。在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲 液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、Taq酶。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单 股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核 苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计遵循以下原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产 物不能形成二级结构。③引物长度一般在15 30碱基之间。④G+C含量在40% 60% 之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连 续4个碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要避开 密码子的第3位。
弓Li殳if 白勺^^牛* Primer Premier 5, Beacon Designer 7。本发明所用引物由上海英潍捷基公司通过亚磷酰胺三酯法合成，亚磷酰胺三酯法 是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向 5'端合成的，相邻的核苷酸通过3' -5'磷酸二酯键连接。具体方法如下1、将预先连接 在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5' _羟基的保护基 团DMT，获得游离的5'-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四 氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶 液中游离的5'-羟基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数 5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这 种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上 去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引 物。本发明中使用的引物序列选自采用以下序列之一的任意引物 相对于现有技术中的方案，本发明的优点是1.高通量1次可同时检测该突变位点10-384个样本2.高敏度在肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0. 的突变 样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中 突变检测。本发明试剂盒由于灵敏度非常高，可以使用在各种组织来源的基因组DNA如血 细胞、口腔粘膜细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。 这采用现有技术中的检测方法是不可能实现的。3.特异性好PCR产物无需后续处理，特异性高达100%。直接未知杂合突变鉴定 准确性100%，特异性100%。


下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳图；图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；图5为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图；图6为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；图7为本发明实施例不同MgCl2终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图和得到的PCR 产物电泳图；图8为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；图9为本发明实施例灵敏度实验图；图10为本发明实施例准确度实验图；图11为本发明应用例甲状腺乳头状癌患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的 溶解曲线图。图12为本发明应用例正常人血浆标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图13为本发明应用例甲状腺乳头状癌患者血浆模板DNA进行扩增后检测的溶解 曲线图。图14为本发明应用例甲状腺乳头状癌患者血清模板DNA进行扩增后检测的溶解 曲线图。图15为本发明应用例黑色素瘤患者血清模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1 引物的设计、合成及验证按照BRAF突变第11外显子和第15外显子的序列，进行引物设计。对引物的不同 序列长度进行扩增比较，筛选特异性好的引物。弓丨物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性结果图1所示，图la为5_9bp的引物 PCR扩增的电泳图，图lb为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图lc为18-24bp的引物PCR 扩增的电泳图，图Id为25-29bp的引物PCR扩增的电泳图，图le为30_37bp的引物PCR扩 增的电泳图，图1 f■为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。表1不同引物大小的PCR扩展结果 根据表1结果和图1所示，可知最佳引物为18_24bp大小的引物。引物合成上海Invtrogen公司合成引物验证用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对合成的引物进行鉴定，包括以下步 骤使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0. 2-0. 50D的引物，用尿 素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95°C，2minS)。加入 尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，约2-3小时后，剥 胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件 许可，也可以用EB染色或银染方式染色；得到电泳图如图2所示。实施例2阴性对照DNA的制作阴性对照DNA的提取1、抽取正常人外周血2.5ml于枸橼酸钠(1 9)抗凝管中。2、抗凝管中的血8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。3、血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，4. DNA提取将抗凝血8000rpm离心5min，吸出上层的血浆，用Blood Mini kit试 剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他 涉及产品同样处理，提取的DNA-20 °C保存。
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5.定量使用Nano 1000定量仪，测定DNA浓度。合格指标1，符合0D值A260/ A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0 要求之间，再将 DNA 定量稀释到 10ng/ul。6.电泳鉴定提取的DNA用1. 0%的琼脂糖凝胶120V电泳25min，电泳条带比较 单一，比较纯，电泳结果如图3 ；测序鉴定将提取的DNA进行PCR扩增后送英潍捷基测序， 测序结果如图4。上述鉴定结果表明，按上述方法所获得的DNA样品符合阴性对照的要求。实施例3 肿瘤组织DNA的提取样本采集取新鲜组织块50 lOOmg以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在 0. 5cm以下，放入装有1. 5ml体积RNAlater的冻存管中，充分混勻。(30分钟内完成)室温下放置1-2小时，4°C冰箱过夜，第二天转至-20°C长期保存。DNA 提取使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组 DNA 提取试 剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。DNA 纯化(若提取的 DNA, 0D 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，没有 在标准范围内，则需要此步骤)加入等体积的氯仿-异戊醇(25 1)，向下翻转离心管5min以充分混勻， 13000rpm离心lOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml离心管；加入1/10体积的醋酸钠(pH5. 2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻 摇勻，沉淀DNA13000rpm离心3min，轻轻倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,离 心3min，去上清液，倒置5-lOmin (倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决 定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入 30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA充分溶解。实施例4 血液中血浆DNA的提取抽取病人外周血l_2ml于枸橼酸纳(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管， 吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管 子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血浆用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例5血液中血清DNA的提取抽取病人外周血l_2ml至非抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另 一无菌管子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期 即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血清用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血清DNA的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品 同样处理，提取的DNA-20°C保存。实施例6石蜡切片组织DNA的提取刮削5-10 ym厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。用 二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20°C保存。实施例7 :PCR-HRM条件优化实验1)热启动Taq酶选择用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如下表和图5，图5中1、2、 3、4 分别为 HotStarTaq 酶、FastStartTaq 酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G 快速热启动 DNA聚合酶的酶活性检测结果图，根据该图最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活 性最高。表2不同厂家的热启动Taq酶活性 2)荧光染料的选择用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如图6所示，图6 中 1、2、3、4、5 分别为 Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo 荧光染料的实验结 果，据图可知最佳染料为Eva Green和LC Green。表3不同厂家的染料的荧光结合效果 染料Eva Green和LC Green的效果最好。3) PCR条件的优化在退火温度、Mgcl2浓度两方面PCR条件进行优化调整，结果如表表4不同MgCl2终浓度和退火温度的PCR扩增结果 60°C时，MgC12 浓度为 2. 0mM，2. 5mM 的实验图如图 7(BRAF-463 和 BRAF-1799)所 示，可以看出，选择退火温度为60°C，Mgcl2终浓度为2. 5mM时为最佳的条件。4)HRM条件优化HRM条件的优化溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面调整表5不同检测荧光次数和起始熔解温度的熔解曲线效果 最佳HRM条件的确定 5)DNA来源样本分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中进行检测模板DNA，检测结果如下表和 图8所示表6不同来源的模板DNA检测结果 图8A D分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片的检测结果，由图可知，外周 血、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。
6)灵敏度实验用实施例1 5获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入 阴性对照样本、1 %突变样本、5%突变样本、10%突变样本、15%突变样本。如图9和表七所 示如图9所示，经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1%。其他检测方法对照 文献Mutation Research 635(2007) 105-117的检测方法灵敏度数据，如下表所示，本试剂 盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1%。表7本试剂盒与其它检测方法灵敏度比较 如图9所示，本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1%。6)HRM检测精度分析用实施例1 5获得的材料和优化的条件，确定检测的精确度。实验中，用BRAF 的引物检测肺癌患者石蜡切片组织，并与直接测序法相比较。如图10所示本试剂盒的检测结果如下表表8本试剂盒和测序检测对照表 结论BRAF_1799引物检测40例石蜡组织切片样本实验中，本试剂盒检测出10例 样本检测有突变分型，实际测序有9例突变，HRM和测序检测成功率100%，阳性检测出率达 测序比较一致性100%，两种方法检测一致率为95%。从检测结果分析，本试剂盒检测突变 的灵敏度超过测序。应用例1甲状腺乳头状癌石蜡切片组织BRAF突变扫描取甲状腺乳头状癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。使用仪器LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、刮削5-10 iim厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作 说明提取DNA
引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 结果讨论用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在甲状腺乳头状癌 病人中检出BRAF G463突变的有5例(检出率大约为16. 7% )，BRAF1799突变的有10例 (检出率大约为33. 3% )，图11A、11B为甲状腺乳头状癌病人石蜡切片组织中BRAF-463和 BRAF-1799突变检测图。符合国内外研究报道的甲状腺乳头状瘤中BRAF基因突变的几率。
应用例2甲状腺乳头状癌血浆的基因扫描抽取病人(共20例)外周血l-2ml于枸橼酸钠(1 9)或EDTA抗凝管中，不用 肝素抗凝管，吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入 另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血浆中的DNA作为模板。使用仪器LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取血浆DNA。引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件
得到如图12A、12B为正常人样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图以及如图 13A、13B为甲状腺乳头状癌患者样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。结果讨论用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在甲状腺 乳头状癌病人中检出BRAF G463突变的有3例(检出率大约为15% ),BRAF1799突变的有 5例(检出率大约为25%)。符合国内外研究报道的甲状腺乳头状瘤中BRAF基因突变的几 率。应用例3甲状腺乳头状癌血清BRAF突变检测抽取病人(20例)外周血l-2ml于非抗凝管中，吸取部分血液至离心管8000rpm 离心5分钟，分离血清和细胞。血清小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血 清中的DNA作为模板。使用仪器LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取血清DNA。引物序列
外显子引物序列
BRAF的第 11 个外显 Forward 5，-CGAGTGATGATTGGGAGATTC-3， PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 结果讨论用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在甲状腺乳头状癌 病人中检出BRAF G463突变的有3例(检出率大约为15% ),BRAF1799突变的有5例(检 出率大约为25% )，图14A、14B为样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。符合国内外 研究报道的甲状腺乳头状瘤中BRAF基因突变的几率。应用例4黑色素瘤血清BRAF突变扫描抽取病人(20例)外周血l_2ml于非抗凝管中，吸取部分血液至离心管8000rpm 离心5分钟，分离血清和细胞。血清小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血 清中的DNA作为模板。使用仪器Light Cycler 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取血清DNA。引物序列
PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 结果讨论用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在黑色素 瘤人中检出BRAF G463突变的有8例(检出率大约为40% )，BRAF1799突变的有10例(检 出率大约为50% )，图15A、15B为样本中BRAF-463和BRAF-1799突变检测图。。符合国内 外研究报道的黑色素瘤中BRAF基因突变的几率。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续 核苷酸序列为SEQ ID No 3 20序列之一的正向或反向核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物 为SEQ ID No 3 20序列之一的正向引物或反向引物。
4.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂 盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系， 所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 10 X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列终浓度为0. 1 0. 5 y M ；模板 DNA0. 1 1. 5ng/ii L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. 10U/ u L ；MgCl2终浓度为1 3mM ；荧光染料1 3X。
5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR 反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 5X;dNTPs0. 2 0. 3mM ；引物序列终浓度为0. 2 0. 3M ；模板 DNA0. 5 1. Ong/ u L ；TaqDNA 聚合酶0. 03 0. 06U/ u L ；MgCl2终浓度为2 3mM ；荧光染料1 2X。
6.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光 染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料、 SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR缓冲液包括Tris cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。
7.—种检测BRAF基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有BRAF基因的第十一外显子BRAF11或第十五外显子BRAF15中 至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRAF基因进行PCR扩增；(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点(BRAF11和BRAF15) 检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细 胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s， 56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR 仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶 解曲线法的条件为92 97°C变性lmin ；40°C复性lmin ；然后初始溶解温度60°C开始程序 升温溶解至95°C，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
10.一种PCR反应试剂盒在肿瘤用药选择和诊断相关的BRAF基因突变检测方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测BRAF基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRAF基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRAF基因的第11外显子BRAF11或第15外显子BRAF15中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRAF11具有SEQID No1的连续核苷酸序列；所述BRAF15具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而为多种肿瘤包括甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、肠癌、卵巢癌等的选择用药和诊断提供指导。
文档编号C12Q1/68GK101875971SQ20101013421
公开日2010年11月3日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者王弢, 王秀娟, 秦勇, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司