Hbb基因突变和hla分型检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因组突变检测领域，特别涉及HBB基因突变和白细胞抗原系统分型 的检测。
【背景技术】
[0002] β-地中海贫血是在全世界范围最常见的单基因疾病，它是由于β珠蛋白基因 突变导致β链的合成受到部分或完全抑制而引起的溶血性疾病。根据β珠蛋白基因表 达的受抑制程度，β-地中海贫血分为两种类型：β珠蛋白链完全不能合成者称为β〇地 中海贫血，β-珠蛋白链尚能合成但合成量减少者称为β+地中海贫血。β-地中海贫血 以小细胞低色素性溶血型贫血肝脾肿大（脾大明显）、骨髓扩增发育迟缓合并感染、骨骼改 变等为主要临床症状。β-地中海贫血在南方地区最为高发，广东、广西β-地中海贫血 携带率分别为 2. 54%和 6. 78%(ChenW,ZhangX，ShangX，etal.Themolecularbasis ofbeta-thalassemiaintermediainsouthernChina:genotypicheterogeneityand phenotypicdiversity.BMCMedGenet. 2010Feb25 ;11:31)。迄今为止，世界范围已发现 800 多种β地中海贫血的基因突变类型（http://globin.cse.psu.edu/cgi_bin/hbvar/ query_vars3)〇
[0003] 目前国内外对β-地中海贫血的治疗分为产前诊断、规范性长期输血和去铁治 疗、HLA相合的造血干细胞移植和脾切除术等（刘越，米佳，黄耀江.人类白细胞抗原基 因研究进展[J].生物学教学.2007(11))。输血治疗存在铁负荷导致的并发症，骨髓移植 则一直无法摆脱免疫排斥和移植抗宿主病的并发症，而造血干细胞具有重建个体造血系 统的全能性和自我更新的能力，理论上将正常的β-珠蛋白基因导入造血干细胞并输回 体内，使之获得适宜表达，患者将获得终生治疗。随着临床的需要、分子细胞生物学及分 子生物学技术的快速发展，PGD已经从避免基因病遗传扩展到以移植造血干细胞为目的对 植入前胚胎进行人类白细胞抗原（humanleucocyteantigen，HLA)分型的非疾病性检测 (VerlinskyY,RechitskyS,SharapovaT,etal.PreimplantationHLAtesting.JAMA 2004May;291 (17) : 2079-85)。在器官移植和造血干细胞移植中，当同种异基因骨髓移植时， HLA不同时可引起免疫排斥反应。由于HLA具有高度多态性，供受者HLA的差异决定了同 种异体器官移植后几乎不可避免地发生免疫排斥反应。配型匹配点越多，移植术后的效果 就越理想，受者存活时间就越长。如果匹配的点少，移植后发生急、慢性宿主抗移植物反应 (hostversusgraftreaction，HVGR)和移植物抗宿主病（GVHD)的机率明显增加，存活时 间短，因此在器官移植、造血于细胞移植中HLA配型的意义重大。正是因为寻找HLA基因型 一致的供者极其困难，近年国外有报道β-地中海贫血这种严重致残、致死而又无法根治 的疾病在有需要进行造血干细胞移植患儿的家庭中，对植入前胚胎进行HLA配型联合或不 联合基因遗传病的PGD检测，选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子（不携带致病基 因）或者杂合子（携带隐性致病基因）胚胎移植，创造一个救助者同胞（SaviourChild， SC)，分娩时使用SC的脐血或者骨髓用于治疗现存患儿，为治疗此类患者提供一种新的、效 果可能更理想的途径（Tur-KaspaI，JeelaniR.ClinicalguidelinesforIVFwithPGD forHLAmatching.ReprodBiomed0nline2015Feb;30(2) :115_9)〇
[0004] β珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂上，覆盖50kb，其结构如图1。从5' 一 3' 分别为胚胎ε球蛋白基因、胎儿Gy和Αγ球蛋白基因、假基因Φβ、δ和β球蛋白基因。 每一编码球蛋白的基因均包含3个外显子、2个内含子。在ε球蛋白基因上游20kb处，有 β球蛋白基因的定位控制序列（l〇cus-control_region，LCR)，它包括5个红细胞系特异的 核酸酶高酶位点，调控着其下游基因的表达（OlivieriNF,Thebeta-thalassemias.NEngl JMed. 1999Jul8 ;341 (2):99-109)。
[0005]β珠蛋白肽链含146个氨基酸，由β珠蛋白基因所编码。β珠蛋白基因全长 1605bp，含3个外显子和2个内含子。β-地中海贫血的分子基础是β珠蛋白基因的点 突变或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白链合成的减少或缺失。中国人群中已发现的大部 分突变集中在基因的3'端调控区、外显子1、内含子1和外显子2中，以⑶41-42 (-CTTT)、 IVS-II-654 (C>T)、CD17 (Α>Τ)、TATA盒nt-28 (A>G)、CD71-72 (+Α)和nt-29 (A>G)这 6 种突 变类型较为常见，约占中国人β-地中海贫血基因突变总数的93.3% (杜传书.地中海贫 血研究的现状与未来[J].中华医学遗传学杂志，1996, 13(5) :257)。
[0006]β-地中海贫血的遗传方式为常染色体隐性遗传，即两条染色体上的HBB基因均 存在缺陷时才会导致β-地中海贫血。一条染色体上的ΗΒΒ基因正常，而另一条染色体上 的ΗΒΒ基因存在缺陷不会致病，此时称之为β-地中海贫血携带者。若男女双方均为β-地 中海贫血携带者，生育β-地中海贫血患儿的风险为25% (图2)。
[0007] 人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA)系统是一群与人体免疫应答反 应密切相关的基因簇，位于第6号染色体短臂6p21. 31区，长约3600kb，占人类基因组的 1/3000,现已完成其全序列的测定（Completesequenceandgenemapofahumanmajor histocompatibilitycomplex.TheMHCsequencingconsortium.Nature. 19990ct28; 401 (6756) :921-3)。它是人类基因组中至今为止最复杂、最具多态性的遗传体系，其等位基 因的多态性影响着免疫应答和抗原肽的递呈等。
[0008]HLA的基因结构HLA复合体目前分为HLA-I、HLA-II和HLA-III三类基因（见图 3)。HLA-I类基因区靠近染色体顶端，长约1500kb，区内基因被命名为经典的HLA-A、B、 C和非经典的HLA-E、F、G等基因。HLA-II类基因最靠近染色体着丝点，长约1000kb，被命 名为HLA-D。HLA-D又划分为HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP等亚区，此外还有DMA、DMB、LMP2、 11^734?1以及14?2等基因位点。！11^-111类基因区位于11类基因与1类基因区之间，长约 1000kb，已检出40多个基因，包括编码补体蛋白C2、因子B、C4A和C4B等基因（BodmerJ G,MarshSG,AlbertEDetal. 1995.NomenclatureforfactorsoftheHLAsystem. TissueAntigens, 46(l):l_18)〇
[0009] β-地中海贫血基因检测方法有：限制性片段长度多态性连锁分析、探针斑点杂 交技术、反向点杂交方法、缺口PCR(Gap-PCR)、扩增不应突变系统、单链构向多态性、DNA芯 片技术、DNA序列测定法、实时荧光定量、多重连接依赖性探针扩增（MLPA)、高效液相色谱 技术（HPLC)。当父母双方携带有明确的HBB基因致病位点，可以通过产前干预措施阻止 致病位点向下一代传递。HLA基因分型方法有：PCR-SS0P(序列特异性寡核苷酸探针）、 PCR-RFLP(限制性片段长度多态性）、PCR-SSP(序列特异性引物）、PCR-SNP(单核苷酸多态 性）、SBT(直接测序分型）和基因芯片。但目前这些基因检测方法灵敏度低，只适合于采用 新生儿外周血作为检测对象，不适合针对单细胞的移植前筛查。因此急需开发一种检测试 管婴儿技术中胚胎HBB基因突变检测和HLA基因分型方法的新方法。
[0010] 采用试管婴儿技术能有效帮助有需要进行造血干细胞移植的β-地中海贫血患 儿家庭。选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子（不携带致病基因）或者杂合子（携 带隐性致病基因）胚胎移植，创造一个救助者同胞（SaviourChild，SC)，分娩时使用SC的 脐血或者骨髓用于治疗现存患儿，为治疗此类患者提供一种新的、效果可能更理想的途径。
[0011] 试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在 恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。挑选健康胚胎移植并且与患 儿HLA基因型一致是成功治疗造血干细胞移植的β-地中海贫血患儿的关键因素。
【发明内容】
[0012] 本发明设计了一种基于高通量测序技术检测ΗΒΒ基因突变和HLA分型的方法。
[0013] 本发明的第一方面提供了一种检测ΗΒΒ基因突变的引物组合物，其包括特异性扩 增人类胚胎β-地中海贫血ΗΒΒ基因上下游1Mb范围内紧密连锁的多态性位点（SNP)的引 物。
[0014] 优选地，所述特异性扩增人类胚胎β-地中海贫血HBB基因上下游1Mb范围内 紧密连锁的多态性位点（SNP)的引物的上下游序列分别选自SEQIDN0:2n-1和SEQID NO: 2n，其中η为1~69的自然数。
[0015] 在一个特定的实施方案中，所述检测ΗΒΒ基因突变的引物组合物包括SEQID NO: 1-138的全部引物序列。