基于酶切灵敏检测人类egfr基因突变的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变 的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是一种由原 癌基因C-erbB-l(HER-l)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正 常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤(如非小细胞肺癌)中往往存在EGFR高表达或异常表达 的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此EGFR已经成 为相关肿瘤(尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的EGFR靶 向药物包括：EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs，如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯）， 以及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明，吉非替尼（Gefitinib)和厄罗替尼 (Erlotinib)的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR 基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型 基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的 前提被列入了最新的NCCN(美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。
[0003] 目前报导的EGFR基因突变检测方法包括Sanger测序、Scorpions-ARMS、 TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等，其中在科研和临床中较为常用的方法为Sanger 测序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探针；Amplificationrefractorymutation system，扩增阻滞突变系统）法。Sanger测序法是基因突变/多样性检测的金标准，具有 技术和平台成熟、结果准确和全面等优点；然而Sanger测序法主要的不足在于检测灵敏度 约只有10-20%左右（即突变基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠检出），且检测过程繁 琐、检测时间长(大致需要2天)，这制约了其临床应用。基于Scorpions-ARMS法开发的如 德国Qiagen公司的EGFR检测试剂盒，可同时检测EGFR基因的29种常见突变，具有灵敏 度高(可测出低至1%水平的突变)、操作简单、快速检测等优点；然而该类进口试剂盒检测 成本过高(每份标本需3000-5000元）限制了其临床的推广和应用。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法和试剂盒的不足，本发明的目的之一 在于提供一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒；本发明的另一个目的在于 提供一种基于酶切的灵敏检测人类EGFR基因突变的方法。
[0005] 由于在EGFR基因片段的扩增体系中加入了针对突变位点的连接引物和耐热DNA 连接酶，导致样品中的野生型EGFR基因片段的扩增将受到有效的抑制，而突变型的扩增则 基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高 于50%，从而保证了酶切对于杂合基因片段体系的有效检测。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 首先，本发明涉及二赴基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包 括10XPCR缓冲液、10X耐热DNA连接酶缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、9条连接引物、耐热 DNA连接酶、DNA聚合酶、10X错配切除酶缓冲液和错配切除酶；所述8条扩增引物其序列 如SEQ.IDNO. 1-SEQ.IDNO. 8 所示，其中SEQ.IDNO. 1 和SEQ.IDNO. 2、SEQ.IDNO. 3 和 SEQ.IDNO. 4、SEQ.IDNO. 5 和SEQ.IDNO. 6、SEQ.IDNO. 7 和SEQ.IDNO. 8 分别用于靶向第 18、19、20、21号外显子片段的扩增；所述9条连接引物其核苷酸序列如SEQ.IDNO. 9-SEQ.IDNO. 17所示，所述连接引物其5'端第一个核苷酸均进行磷酸化修饰，其中SEQ.IDNO. 9 靶向第18号外显子的3种突变位点，SEQ.IDNO. 10靶向第19号外显子的19种突变位点， SEQ.IDNO. 11-SEQ.IDNO. 15 靶向第 20 号外显子的 5 种突变位点，SEQ.IDNO. 16-SEQ.ID NO. 17靶向第21号外显子的2种突变位点；所述错配切除酶为T7核酸内切酶I或芹菜Cel I酶，酶活单位不低于500单位/mL。
[0007] 其实，本发明实现涉及一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法，通过在 EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点处的特定连接引物组，可以 基于扩增片段条带直接判定野生型样本或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变 片段的比例高于50% ;然后通过变性和退火，制备在突变位点处含有错配构造的DNA片段杂 交样品，从而利用错配切除酶实现对杂合基因片段样品的有效检测&
[0008] 更具体地，基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，具体步骤和 本发明试剂盒相关内容如下： (1)样本采集和基因组DNA提取 采集或取出待测生物样本如患者的肿瘤组织或外周血等，利用相应的试剂盒提取其基 因组DNA。
[0009] (2)EGFR基因特定片段扩增 采用本发明试剂盒分别配制EGFR基因外显子组合的含连接酶扩增体系即正常体系， 一共需要配制5管；所配制的5管扩增体系除了扩增引物和连接引物不同外其余均相同，如 表1所示： 表1EGFR基因外显子正常扩增体系（25uL)
同时配制对应的不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种组分 的对照扩增体系5管，体系配制参照表1，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补，其余组分 同对应的正常体系。
[0010] 共5管正常体系(含连接酶扩增体系）和5管对照体系（不含连接酶扩增体系）在 基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95°C预变性5-10min;94°C变性 15-30s，50-53°C退火 45-90s，72°C延伸l_2min，循环 30-36 次；72°C终延伸 10_12min。
[0011] (3 )扩增产物的电泳分析 所有的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0. 5ug/ml的EB溶液中染色20min并用 清水脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。在对照体系成功扩增出目的基因片段的情况 下，以电泳图谱中的DNAMarker条带为标准，选取正常体系中出现目的扩增产物条带明亮 即其浓度不低于5ng/uL的那些管，以及和其对应的对照体系扩增产物管备用。
[0012] (4)DNA片段杂交样品的制备 将（3)中选取的各正常体系及其对应的对照体系的扩增产物，混合于新的PCR管中配 制混合DNA片段体系，将其置于PCR仪上进行变性和退火，从而获得DNA片段杂交样品； 将（3)中选取的各正常体系及其对应的对照体系的扩增产物，按照一定体积比混合于 新的PCR管中，添加一定量的PCR缓冲液和去离子水后在PCR仪上进行变性和退火，从而获 得DNA片段杂交样本。
[0013] (5)DNA片段杂交样品的酶切分析 利用可以有效识别并切除DNA双链上错配位点的酶(简称错配切除酶)处理（4)中制备 的DNA片段杂交样本，反应后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarker为参照，分析 得到的实际酶切带型和对应的理论酶切带型的一致性情况。
[0014] (6)EGFR突变结果判定 以DNAMarker条带为标准，在对照体系正常扩增的情况下，如果正常体系中的各目的 扩增片段条带微弱即其浓度明显低于5ng/uL，则无需进行酶切和后续操作直接判定样品的EGFR基因检测结果为阴性即野生型；如果某些目的条带明亮即其浓度不低于5ng/uL，且酶 切产物电泳带型和对应的理论酶切带型一致的话，则判定样品的EGFR基因检测结果为阳 性即突变型，突变类型以对应的理论酶切带型代表的突变为准；如果目的条带明亮即其浓 度不低于5ng/uL，但无显见的酶切带型出现或出现的酶切带型与对应的理论酶切带型不一 致的话，则判定样品此次EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定。
[0015] 其中，步骤（1)中样本的采集对象若为肿瘤患者则应在其充分知情同意的前提下 进行；采集或取出的组织样本包括但不限定于新鲜组织、冰冻组织、甲醛浸泡组织和甲醛固 定石蜡包埋组织切片，血液样本包括但不限定于新鲜血液、血浆和血清，其它生物样本包括 但不限定于胸水、腹水和肿瘤脱落细胞，样本采集或取用量等取样要求和前处理按照对应 的基因组提取试剂盒执行；提取样本基因组DNA后，利用琼脂糖凝胶电泳或吸亮度法评估 其提取量(浓度）和纯度，需要保证EGFR基因片段的有效扩增：如基因组DNA的提取量不少 于200ng，纯度以0D26。/ 0D2S。在1. 8-2. 0之间为宜。
[0016] 其中，步骤（2)中采用的本发明试剂盒的组分如表2所示： 表2本发明试剂盒组分
表2中，编号1-7的组分是用于步骤（2)中的目的片段扩增的，编号8和9两种组分是 用于步骤（5)中的酶切反应的。其中10XPCR缓冲液是由100mmol/LTr