鸡mmp13基因5′调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡MMP13基因5'调控区的两个突 变位点的分子标记方法及其育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 胞外基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs)与其相关的内生性抑 制剂共同构成MMP系统，参与细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM)重塑的调节诸如细 胞增殖、颗粒细胞分化及卵巢血管化结构的形成和降解等过程。MMP13亦称胶原酶3,能够 切割纤维和非纤维胶原。其能够催化纤维胶原蛋白三股螺旋的关键结构域，使得胶原蛋白 的稳定性和溶解性发生变化。Balbinetal(1996)和Huangetal(1999)研究表明，MMP13 参与大鼠发情周期调节，尤其是在胚胎着床期起重要作用，是参与卵巢功能调节的主要金 属蛋白酶；朱桂玉（2014)等通过高通量测序发现MMPs家族在白来航鸡开产前后卵巢中存 在差异，其中包括MMP13基因。
[0003] 分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影 响，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，从而加速育种过程及精准度。基因表达是生命过程 中的细胞把储存在DNA序列上的遗传信息经过转录和翻译，转变成蛋白质的过程。其中，转 录受5'调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。因 此，研究鸡MMP13的5'调控区的SNPs，有助于找到有意义的分子标记，为鸡的标记辅助选 择育种提供有利的理论依据。
【发明内容】
[0004] 根据现有技术，发明人进行了进一步的研究和实验，具体涉及了 一种鸡MMP13 基因5'调控区突变位点的分子标记方法及其育种中的应用，发明人发现鸡MMP13 5' 调控区存在 6 个突变位点，即-1719(T>C)、-1661(C>A)、-1356(G>A)、-1128(A>G)、-10 94 (C>A)和-1079 (T>C)位点，并用SHEsis在线软件进行了连锁不平衡分析，结果发 现-1719和-1661、-1356和-1128、-1094和-1079位点分别呈现完全连锁状态。因此， 取-1719、-1356和-1079位点进行单个位点标记分析，结果发现-1356和-1079位点均与 开产日龄相关，AC/AC基因型的开产日期显著早于GT/GT和GT/AC基因型。可见检测这两 个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为育 种工作提供有利的帮助。
[0005] 本发明的具体标记方法是：
[0006] 采用标记引物P-MMP13，包括
[0007]P-MMP13-F，其序列如SeqIDNo:l所示；
[0008]P-MMP13-R，其序列如SeqIDNo:2 所示；
[0009] 扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到 的序列如SeqIDN〇:3所示，结果检测到存在6个突变位点，即-1719(T>C)、-1661(C>A)、-1 356 (G>A)、-1128 (A>G)、-1094 (C>A)和-1079 (T>C)位点。
[0010] 在开产晚的群体中，选择GT/AC基因型个体的公母鸡通过相互交配得到AC/AC基 因型个体的后代，然后对AC/AC基因型个体进行繁育扩群，即可以得到全为AC/AC基因型开 产早的群体。
[0011] 通过这种标记方法得到的AC/AC基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性 能低的地方品种中有意增加AC/AC基因型的频率对提尚广蛋量是一个有效措施，而对于开 产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。 (四）
【附图说明】
[0012] 图1为P-MMP13-F/R引物PCR扩增的片段电泳图，
[0013]图 2 为鸡MMP13 5' 调控区-1719(T>C)、-1661(C>A)、-1356(G>A)、-1128(A>G)、-1 094 (C>A)和-1079 (T>C)位点的多态性测序图；
[0014] 图3为隐性白洛克鸡中6个多态位点的连锁不平衡关系图；
[0015] 图4为构建点突变pGL3_载体后序列比对结果；
[0016] 图5为wt-MMP13和mut-MMP13两种基因型双荧光素酶报告基因启动活性检测示 意图； (五）
【具体实施方式】
[0017] 实施例1鸡MMP13 5'调控区序列比对及多态性位点分析
[0018]1.试验材料
[0019] 隐性白洛克鸡（山东纪华家禽育种有限公司），随机采样，翅静脉采血，提取基因 组后，-20 °C保存。
[0020] 2.试验方法
[0021] 2.1引物设计
[0022] 根据已发表红色原鸡序列（GenBankAccessionNC_006088. 3)设计引物 P-MMP13(其序列详见表1及SeqIDNo:l和2)，此引物是为研究鸡MMP13 5'调控区的突 变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。
[0023] 2. 2PCR扩增
[0024] 随机选取36只隐性白洛克鸡基因组，用引物P-MMP13进行PCR扩增。引物 见表 1，反应体系 20yL，其中包括lyL基因组DNA(50-100ng)，2yL10XEx-buffer， 1.6卩1^(1贈8(2.511116&。11，丁&1^1^)，上下游引物各0.4卩"10卩]\1)，0.1卩1^叉-丁&1〇熟 polymerase(5U/yL，TaKaRa)，ddH20 补足至 20yL。扩增程序：94°C预变性 5min;94°C变性 30sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，进行35个循环；循环结束72°C孵育5min。
[0025] 将36只个体的PCR扩增产物随机混合分为6组，进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖 凝胶回收试剂盒（AxyPrepDNAGelExtractionKit，AXYGEN)进行回收，送济南博尚生物 技术公司测序。
[0026]表1引物的序列、位置和退火温度
[0027]
[0028] 3.结果与分析
[0029]PCR产物电泳见附图1，目的片段804bp。
[0030] 使用DNAMANversion7. 0比对序列同源性和完成突变核苷酸的检索，用 ChromasPro软件对测序结果分析，发现扩增的隐性白洛克鸡MMP13 5'调控区-1719(T>C) 、-1661(0厶）、-1356(6>厶）、-1128(厶>6)、-1094(0厶）和-1079〇'〉〇位点（见附图2) 〇
[0031] 实施例2鸡MMP13 5'调控区多态性与开产日龄和产蛋量的关联分析
[0032] 1试验材料
[0033] 随机选取37只济宁百日鸡（济宁大唐百日鸡保种场）、53只文昌鸡（海南省文昌 鸡育种公司）、46只汶上芦花鸡（山东省济宁市汶上县）、45只海兰褐鸡（山东泰安海兰褐 育种公司）和有产蛋记录的隐性白洛克鸡510只（山东纪华家禽育种有限公司）。以上均 为随机采样，翅静脉采血，提取基因组后，-20 °C保存。
[0034] 2试验方法
[0035] 2. 1PCR扩增
[0036] 以基因组为模版，进行PCR扩增。引物见表1，反应体系40yL，其中包括2yL基因 组DNA(50-100ng)，4yLlOXEx-buffer，3.2yLdNTPs(2. 5mMeach，TaKaRa)，上下游引物 各0·8μL(10μM)，0·2μLEχ-TaqDNApolymerase(5U/μL，TaKaRa)，ddH20补足至40μL。 扩增程序：94°C预变性4min;94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，进行35个 循环；循环结束72°C，孵育5min。
[0037]PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（AxyPr印DNA GelExtractionKit，AXYGEN)进行回收，送济南博尚生物技术公司测序。
[0038] 2. 2单倍型构建及关联分析
[0039] 利用DNAMANversion7. 0和ChromasPro对突变位点进行统计分析。
[0040]R软件用于统计基因型和基因型频率，PHASE软件用于单倍型构建。
[0041] 数据统计采用SAS8. 1统计软件包的GLM程序进行基因型与性状（产蛋数、开产日 龄）的关联分析。
[0042] 不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值土标准误表 示（LSM土SE)，显著水平设定P〈0. 05。
[0043] 3结果与分析
[0044] 3. 1MMP13 5'调控区6个突变位点在隐性白洛克鸡中基因型和等位基因频率的 分布
[0045] 用SHEsis在线软件分析MMP13 5'调控区6个突变位点在隐性白洛克鸡中的连锁 不平衡关系，结果表明：-1719和-166U-1356和-1128、-1094和-1079位点分别呈现完全 连锁状态（附图3)。故取-1719、-1356和-1079位点进行单个位点标记分析。
[0046] 共统计隐性白洛克510个个体，由表2可知，-1719、-1356和-1079位点的优势等 位基因分别为T、G、T;野生纯合基因型和杂合基因型的频率均高于突变纯合基因型。
[0047] 表2隐性白洛克鸡中多态位点的基因型和等位基因频率
[0048]
[0049] 3· 2MMP13 5'调控区-1719、-1356和-1079位点多态性分析及其与生产性能的关 联分析
[0050] 3. 2. 1MMP13 5'调控区多态性位点在不同鸡品种中的分布
[0051] 统计了白洛克、海兰褐鸡、文昌鸡、济宁百日鸡和汶上芦花鸡品种的基因型和等位 基因频率。其中，海兰褐鸡中的-1719与-1661位点没有检测到突变基因型，其他位点分析 结果见表3至表8。
[0052] 表3MMP13 5'调控区-1719位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0053]
[0054] 表4MMP13 5'调控区-1661位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0055]
[0056]表5MMP13 5'调控区-1356位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0059] 表6MMP13 5'调控区-1128位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0060]
[0061] 表7MMP13 5'调控区-1094位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0062]
[0063] 表8MMP13 5'调控区-1079位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0064]
[0065] 3. 2. 2隐性白洛克中MMP13 5'调控区-1719、-1356和-1079位点多态性与生产 性能的关联分析
[0066] 在510只隐性白洛克群体，分析MMP13 5'调控区-1719、-1356和-1079位点对32 周（E32)产蛋数的效应，结果均未达到p〈0. 05的统计显著水平。但对开产日龄（AFE)，-1356 和-1079位点均达到p〈0. 05的统计显著水平，分别为AA型和CC型的个体开产较早。表明 两个突变位点纯合基因型均与开产早的性状有关联。
[0067]表9.白洛克中不同基因型与开产日龄及产蛋数的关联分析
[0068]
[0069] 注：表中数值为AFE(开产日龄）和E32 (32周产蛋量）的最小二乘均值土标准 误，不含相同字母最小二乘均值间差异显著（P< 〇. 05)。
[0070] 3. 3MMP13 5'调控区-1356和-1079位点单倍型分析及其与生产性能的关联分析
[0071] 3. 3. 1MMP13 5'调控区单倍型在不同品种中的分布
[0072] 用PHASE软件对鸡MMP13基因5 ^调控区-1356和-1079突变位点构建了四种单 倍型：GT、GC、AT和AC。由表10看出，鸡MMP13