公鸡性早熟相关基因——gdf9基因5’调控区snp分型及启动子活性快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于生物技术领域，利用PCR-RFLP和双报告基因技术检测提供一种 公鸡性早熟相关基因--生长转化因子_9 (GDF9) 5'调控区SNP分型及启动子活性快速检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 生长转化因子-9 (growth differentiation factor-9，GDF9)是转移因 子(TGF-0)超家族的成员之一，作为控制哺乳动物繁殖性状的主效基因或候选基因 已被报道（Hanrahan at el 2004，Palmer at el 2010，Barzegari，at el 2006)。研宄发 现GDF9在母鸡的卵巢中特定表达，并能促进鸡卵母细胞的有丝分裂、加强颗粒细胞的增殖 (Johnson at el 2005)。尽管⑶F9对雌性动物的繁殖能力起重要作用，其在雄性动物的研 宄中却很少，且仅停留在表达水平。研宄发现⑶F9在人和牛的睾丸中表达（Aaltonen at el 1999，Pennetier at el 2004)，⑶F9是大鼠睾丸的生殖细胞特异性因子，并可以调节 调节睾丸支持细胞的生长（Nicholls at el 2009)。但GDF9在公鸡的研宄却没有报道，鸡 冠的发育是鸡第二性征中最明显，最重要的特征，可作为衡量性成熟程度的指标（雷秋霞， 2005)，因此⑶F9基因可以作为控制公鸡性成熟的主效基因或候选基因。
[0003] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，作为第三代遗传标记 已得到飞速发展，目前已经有多种发展成熟的检测技术，如单链构象多态性（SSCP)、限制性 酶切片段长度多态性（RFLP)、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。限制性片段长度多态 性聚合酶链反应（PCR-RFLP)技术就是利用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶 消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分型。该技术具有特异性高、检测快速、通用 性强、适用范围广、成本低廉等特点，目前已成功应用于人类疾病及禽病相关基因分子标记 的SNP检测和基因诊断试剂盒的研发。
[0004] 报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定 目的基因的表达调控。该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检 测。目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等 多种细胞事件。随着技术和检测方法的进步，荧光分析以其能够将细胞内报告基因的活性 可视化和对细胞的非破坏性而越来越成为主流，因此荧光素酶和绿色荧光蛋白这两种可发 出荧光的报告基因成为众多报告基因中的后起之秀。双报告基因技术结合了萤火虫荧光素 酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简 便。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，双报告基因技 术使偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条 件变化所干扰，确保了实验结果的准确性。
[0005] 经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有GDF9基因5'调控区多态性位 点及其启动子活性与公鸡性早熟相关性的报道。 【实用新型内容】
[0006] 本实用新型的目的是为了给公鸡性早熟相关基因一一⑶F9基因5'调控区 G-333T(由启动子的第一个碱基向调控区方向的第333个碱基）位点的检测提供一种基因 分型及启动子活性检测试剂盒，该试剂盒准确性高、快速、价格低廉。
[0007] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，公鸡性早熟相关基因一一⑶F9基 因5'调控区SNP分型及启动子活性快速检测试剂盒，包括盒体，盒体为双层结构，包括上层 盒体和下层盒体，上、下层盒体内均设有衬垫，衬垫上设有孔腔；所述下层盒体为低温层；
[0008] 上层盒体衬垫孔腔内分别设有用于⑶F9基因5'调控区PCR扩增的上下游引物混 合物、DNATag酶扩增缓冲液、内切酶缓冲液、dNTP、转染试剂、、1XPBS;
[0009] 下层盒体衬垫孔腔内分别设有DNATag酶、Hin6I内切酶、 pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promoter质粒 1、pGL3-GDF9-333-TT-Basic/promoter质粒 2、pGL3_Basic质粒 3、pRL-CMV质粒 4、Dual-GloLuciferaseReagent双焚光素酶试剂、 Dual-GloStop&GloSubstrate双焚光素酶终止反应底物、Dual-GloLuciferaseReagent Buffer双荧光素酶缓冲液。
[0010] 优选地，所述盒体横截面是椭圆形。
[0011] 优选地，所述盒体上设有盒盖，盒盖为椭圆形。
[0012] 引物混合物P表示用于⑶F9基因5'调控区PCR扩增的上下游引物混合物，引物 信息如下：
[0013] 上游引物S:5'CACCACAGTCAAAACAGCTTTAAGA3'
[0014] 下游引物A:5'GTCAGGCTGAGCCTTTGCAC3'。
[0015] 质粒 1 (pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promoter)表示将启动子区域（-333 碱基为 G) 正确插入报告基因质粒（pGL3-Basic)中的重组质粒（大写字母为启动子区域，小写字母为 pGL3-Basic质粒部分序列，带框ATG为启动子，带框G为启动子第一个字母向调控区方向的 第333个碱基），其信息如下：
[0016] ggtaccgagctcttacgcgtCACCACAGTCAAAACAGCTTTAAGAGATGTAAGAAAAAAGGTGATGTT GTTTCACATTACAGATTGCTATCTGAATTAACCTTCCACTCCAAATGAAAGAATTCTGTAAGTCAATTAAGCATTCT CTGAACAAGCACTCCTTACTTAGAAGCCGTAAGATGTGAAAGCTAGATTACAGGTGACACTTCACTAGATTACTGAC AGCACAGCTCTAATTAAAAACATCTGGCATGAAAACACATTCCCTTACACATTTTCCTCACTCAATAAAACAAAAAT CCACCCCTTTCATTACATCCTGTAAGAAGAGTTTCTAAACACTCCAGGCAGGCACTACTACTCCAGTCGGAGTCTTC GGGAGCAATAATGTTTAGCATCTTATATACATTTAGCAATGCTAACTGGCGCTGTTGCTGCCCTTGCTTTAACAGCT AACCCACGAATACCGGAATTCCCGCAGGTCGCGCTCTCAGCCGGACCGGCGGCATCCCTTCCCCTCCCGGCTCCCCC TGGGGGCCGATCCACGAACAGTCGTGCCTTACAGTTTACCAGGTAGAAAAGTGTAACCCTGAGAAGCAGCGTTTGTT GGTGAGACGCCGCCACGTGCAAAGGCTCAGCCTGACCGCACACACACACGTGGGTTCCACAGCCAGCTGCGGGGCTT TCCCTTTGGTTTCTAATCACAAAGAAACCTCCCTCCTGAGCCACAGCTGAAACACATATAACAGCTCGAGCTCGCGT GCTCTTTTTTCTTGAATGCTTGGGGGGAGGCGTTGTTAGGCTACAGCCCTGAAGAGCAT^GAGGGTACGTGGAGG ATCTGTGTTTGTTTCTATTGCTGCATTCACTGGCTTctcgagatctgcgatctaagtaagctt
[0017] 质粒 2 (pGL3-DRDl-333-TT-Basic/promoter)表示将启动子区域（-333 碱基为 T) 正确插入报告基因质粒（pGL3-Basic)中的重组质粒（大写字母为启动子区域，小写字母为 pGL3-Basic质粒部分序列，带框ATG为启动子，带框T为启动子第一个字母向调控区方向的 第333个碱基），其信息如下：
[0018] ggtaccgagctcttacgcgtCACCACAGTCAAAACAGCTTTAAGAGATGTAAGAAAAAAGGTGATGTTG TTTCACATTACAGATTGCTATCTGAATTAACCTTCCACTCCAAATGAAAGAATTCTGTAAGTCAATTAAGCATTCTC TGAACAAGCACTCCTTACTTAGAAGCCGTAAGATGTGAAAGCTAGATTACAGGTGACACTTCACTAGATTACTGAC AGCACAGCTCTAATTAAAAACATCTGGCATGAAAACACATTCCCTTACACATTTTCCTCACTCAATAAAACAAA