一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种启动子及其应用，尤其涉及一种调控基因在分泌型腺毛中表达的 启动子及其在基因工程技术领域的用途。
【背景技术】
[0002] 青蒿（ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取 的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物一一青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药 物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法（ACTs)是世界卫 生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完 全满足全球的市场需求。青蒿具有分泌型腺毛（glandulartrichomes)和非分泌型腺毛 (nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、莖杆、花上都大量存在分泌型腺 毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。
[0003] ABC(ATP binding cassette)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家 族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。AaPDRl是从青蒿中克隆得到的 一个ABC转运蛋白中]^I^Pleiotropic drug resistance)亚家族的转运蛋白。AaPDRl在 叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中分泌型腺毛特异性表达的 基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可 能在青蒿的分泌型腺毛中特异性表达。从而克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代 谢工程具有较为重要的意义。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成 性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内 代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于分泌型腺毛特异表达 的启动子只对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物造成代谢的浪费和生长发育造成 危害。因此，克隆AaPDRl基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工 程育种具有重要意义。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaPDRl基因 启动子序列相关的报道。
[0004] 因此，本领域的技术人员致力于开发一种AaPDRl基因的启动子。
【发明内容】
[0005] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种调控基因在 分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，具体为一种AaPDRl基因的启动子，即青蒿中一个 ABC(ATP binding cassette)转运蛋白中]^I^Pleiotropic drug resistance)亚家族的转 运蛋白的启动子。
[0006] 本发明所提供的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 进一步地，该启动子为诱导型启动子。
[0008] 本发明所提供的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子，可用在在植物生产代谢 产物的基因工程育种中。
[0009] 本发明提供的启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植 物分泌型腺毛中特异表达。
[0010] 本发明提供一种载体，所述载体连接有上述调控基因在分泌型腺毛中表达的启动 子。
[0011] 本发明提供一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，包括以下步 骤：
[0012] 步骤一、培养青蒿无菌苗；
[0013] 步骤二、根据青蒿全基因组中AaPDRl基因启动子序列，克隆启动子序列；
[0014] 步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定 所述启动子类型；
[0015] 步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
[0016] 步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
[0017] 步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
[0018] 步骤七、PCR检测转基因植株；
[0019] 步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
[0020] 进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增分泌型 腺毛特异启动子序列。
[0021] 进一步地，所述步骤三中调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用 元件包括：TATA-box，ABRE，ACE，CAAT-box，CCAAT-box，HSE，G-box、TATA-box或CAAT-box， 启动子序列中调控元件见表1和图1。
[0022] 表1启动子序列中调控元件分析
[0023]
[0024] 进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切 位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下所示：
[0025] Pstl-Pro-PDRl-FP ：GACTGCAGAAGATCTTCGCCTACAACCA
[0026] Pro-PDRl-BamHI-RP ：CGGGATCCGTTAACTCACAATCAAGAT
[0027] 进一步地，所述步骤六具体包括：
[0028] 1)外植体的预培养；
[0029] 2)农杆菌与外植体的共培养；
[0030] 3)抗性再生植株的筛选。
[0031] 本发明具有如下有益效果：本发明提供的AaPDRl基因启动子，可特异性地在分泌 型腺毛组织启动并高效表达外源基因，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产 物的基因工程育种中。
【附图说明】
[0032] 图1为AaPDRl基因启动子区域的顺式作用元件结构图；
[0033] 图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；
[0034] 图3为利用AaPDRl基因启动子与⑶S基因融合的载体1391Z_AaPDRl转化青蒿后， 所获得的转基因青蒿中的⑶S组织染色图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0036] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册见NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的 1989 年版 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0037] 本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根 癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008, 28 (3) :38-43》文献 中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA 公司购得，菌株编号为Gambarl。
[0038] 实施例
[0039] 本实施例涉及AaPDRl基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
[0040] 步骤一，培养青蒿无菌苗
[0041] 青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡11^11，再用20%(?八）的似(：10浸泡 20min后，无菌水冲洗3次~4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培 养基上，25°C、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
[0042] 步骤二，根据青蒿全基因组中AaPDRl基因启动子序列，巢式PCR克隆启动子序 列；
[0043] 为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，使用的引物如表2所示， AaPDRl-FPl和AaPDRl-RPl是根据青蒿全基因组数据库中AaPDRl基因序列和其的启动子 序列设计的特异引物，首轮PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94°C预变性10min; 94°C40s，5(TC40s，68°C3min，34 个循环；68°C延伸 10min。
[0044] 表2巢式PCR引物
[0045]
[0046] 表3 PCR的反应体系
[0047]
[0048] 表4PCR的反应体系
[0049]
[0050] 首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是 AaPDRl-FP2和AaPDRl-RP2,反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94°C预变性lOmin; 94°C40s，55°C40s，68°C2min，34 个循环；68°C延伸lO