检测玉米褪绿斑驳病毒用引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002]玉米褪绿斑驳病毒{Maize chlorotic mottle virus , ΜΟΜ?)是我国颁布的禁止进境的检疫性有害生物。是一种直径30mm二十面体，正单链RNA植物病毒，它属于番前丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属((Machlomoviru)，可通过昆虫介体和种子传播。该病毒的自然寄主有玉米、小麦、黍、大麦等。寄主被侵染后，症状表现为褪绿斑驳、坏死、矮化、穗发育差或无穗、过早死亡等症状。玉米褪绿斑驳病毒可引起10% -15%的产量损失，实验的玉米损失达59%，同时可与小麦线条花叶病毒(紛eai streak mosaic virus,WSMV),甘鹿花叶病毒(azosaic κ/τ?Λ?，SvMV)或玉米矮花叶病毒(ifeize dwarfmosaic κ/τ?Λ?，MDMV)复合侵染，形成玉米致死性坏死病(maize lethal necrosis, MLN),可造成平均高达75%的产量损失，给玉米带来毁灭性灾害。
[0003]该病毒主要分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国(堪萨斯州、内布拉斯加州、夏威夷)等地。目前，我国仅云南省有该病毒发生的报道。随着玉米产业的迅速发展，种植者及加工企业对优良品种的需求越来越大，跨国种子企业试图进入玉米等种业市场的要求越来越强烈。我国近年来玉米种子的国际贸易越来越频繁，使其传入的风险也越来越大，该病毒一旦发生，将导致我国的玉米经济损失高达140亿元人民币。国内学者对该病毒的研究较少，因此相关资料及其防治经验很少。
[0004]近年来发展的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法因其具有灵敏、快速、特异性强等优点，在植物病毒的检测上显示出强大的优势。自1990年起，国内外己相继用RT-PCR方法检测了多种病毒，如:马铃薯Y病毒(PVY)，马铃薯卷叶病毒(PLRV)，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)等。目前对玉米褪绿斑驳病毒基本都是基于其外壳蛋白(CP)基因的研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物。
[0006]本发明的目的之二在于提供该玉米褪绿斑驳病毒的检测方法。
[0007]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物，其特征在于该引物为:SEQ ID N0:2和SEQ IDNO:3所示的碱基序列。
[0008]一种检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，采用上述的引物进行PCR扩增，其特征在于该方法的具体步骤为:提取玉米褪绿斑驳病毒以及阴性病毒的总RNA，反转录为cDNA，最后进行PCR扩增，检测凝胶电泳检测扩增产物在301bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有玉米褪绿斑驳病毒；如果不存在，则说明样品中不含有玉米褪绿斑驳病毒。
[0009]上述的反转录法为:RNA模板2 μ L，RNase-Free H2O 6 μ L混合，反应温度:65°C4min，冰上放置2min ;将5Xg DNA Buffer 2 μ L加入混合液中，反应温度42°C 3min ;向上述 10 μ L 体系中加入 1XFast RT Buffer 2 μ L，Enzyme Mix I μ L，10 μ M 反向引物 MR0.5 μ L^PRNase-Free H2O 至 20 μ L，反应温度 42°C 22min, 95°C 3min，_20°C保存备用；
上述的PCR扩增的体系为:50 μ L的PCR反应体系:10XPCR反应缓冲液5 μ L，dNTP为5 μ L，10 μ M上游引物和下游引物分别为I μ L，模板溶液为I μ L，TAQ酶为I μ L，最后补充ddH20 至 50 μ L ;
上述的PCR法的PCR检测体系的具体参数为:94° C预变性2min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为:94° C变性30s，55° C退火30s，72° C延生Imin ;循环30次后，最后72° C延生lOmin，降温至4° C，PCR扩增结束。
[0010]登录号为EU358605.1的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列为SEQID NO:1所示的碱基序列，序列中下划线部分的字母代表了引物MCMV-F和MCMV-R的位置
上游引物MCMV-F序列如SEQ ID NO: 2所示，序列特征:
长度:20bp 类型:核酸链型:单链拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
下游引物MCMV-R序列如SEQ ID NO: 3所示，序列特征为:
长度:20bp 类型:核酸链型:单链拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成
本发明的优点和有益效果:对本发明的引物的特异性和灵敏度进行分析的结果，8株玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品在301bp处均扩增出特异性条带，而阴性病毒在301bp处都未扩增出特异性条带。证明该引物具有良好的特异性。
[0011]通过对引物灵敏度分析，该特异引物的灵敏度高，因此在样品量较少或者病毒含量在样品组织中含量很低的情况下，也能用该引物检测。
[0012]本发明通过合成一对扩增玉米褪绿斑驳病毒Plll基因其中一部分序列的寡核苷酸引物，利用RT-PCR技术建立一种经济简便检测玉米褪绿斑驳病毒的方法。基于对病毒的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列分析设计的特异性反转录引物的检测方法，在植物病毒检测上具有快速、灵敏、特异性强的特点。
【附图说明】
[0013]图1为实施例1中RT-PCR检测方法特异性评价凝胶电泳图；
图2为实施例2中RT-PCR检测方法灵敏度评价凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0014]结合具体的实施例，进一步进行阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。所述试剂盒生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0015]实施例1:
一种玉米褪绿斑驳病毒RT-PCR检测方法，包括以下步骤:
步骤1，引物设计和合成
利用PR頂ER PRIMER5.0软件根据玉米褪绿斑驳病毒的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列设计I对寡核苷酸引物，上游弓I物MCMV-F和下游引物MCMV-R上游引物及其序列为:
MCMV-F (SEQ ID NO:2):5’-TGGAGCGAGTATTTTATGTG-3’
下游引物及其序列为:
MCMV-R (SEQ ID NO:3):5’-GGTACAGGATCAGCTTTCTT-3’
步骤