一种同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细菌的检测技术，特别是同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的 试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 黄颡鱼属于鲇形目，鳇科，黄颡鱼属，又名黄辣丁，其肉质细嫩、脂肪含量低、蛋白 含量高而深受广大消费者喜爱。但随着养殖规模的扩大、养殖密度的提高，使得养殖环境不 断恶化，养殖过程中不断爆发病害，给养殖户带来巨大经济损失。其中弧菌属细菌、鮰爱德 华氏菌已发展成为黄颡鱼的主要致病原。
[0003]鮰爱德华氏菌，属于肠杆菌科爱德华氏菌属细菌，以会引起黄颡鱼"裂头症";弧菌 属细菌中，如鳗弧菌、拟态弧菌等，引起的黄颡鱼弧菌病，与鮰爱德华氏菌引起的症状相似。
[0004]目前，对弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的检测均是分别检测，一次只能检测一种病 原体，不利于混合感染的检测，且需要大批量的样品进行检测，工作量较大，成本也较高。
[0005]目前，未见同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的试 剂盒和检测方法。
[0007] 本发明首先提供了SEQIDNO. 1~2与SEQIDN0. 3~4所示的引物对。
[0008] 本发明还提供了SEQIDNO. 1~2和SEQIDN0. 3~4所示的引物对在制备同时 检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的试剂中的用途。
[0009] 本发明同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒，它包括SEQIDNO. 1~2 和SEQIDNO. 3~4所示的引物对。
[0010] 本发明同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的方法，它包括如下步骤：
[0011] (1)提取样本DNA :取待检样本，提取其中的DNA ;
[0012] (2)基因扩增：用权利要求4所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
[0013] (3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
[0014] 其中，所述待检样本为养殖水体。
[0015] 本发明提供的试剂盒和方法可以同时分别扩增弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的基 因片段，实现了在同一反应体系中一步检测两种病原菌，且二者之间不会相互影响，特异性 强、灵敏度高、耗时短，步骤简单，工作量下，成本低廉，用于快速检测养殖水体，可及时有效 地预防鱼病的发生，具有良好的应用前景。
[0016] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0017] 图1双重PCR引物测试电泳图。1 :Marker I ;2 :空白对照；3 :爱德华氏菌；4 :弧 菌；5 :爱德华氏菌+弧菌；6 :爱德华氏菌+弧菌
[0018] 图2双重PCR特异性测试电泳图。1 :Marker I ;2 :无乳链球菌；3 :海豚链球菌；4 : 荧光假单胞菌；5 :嗜水气单胞菌；6 :柱状黄杆菌；7 :标准豚鼠气单胞菌；8 :柱状黄杆菌；9 : 沙门氏菌；10 :芽孢杆菌；11 :温和气单胞菌；12 :嗜麦芽寡养单胞菌；13 :副溶血弧菌；14 : 阳性样品。
[0019]图 3 双重 PCR 灵敏度测试电泳图。1 :100 ;2 :10 S3 :10 2;4 :10 3;5 :10 4;6 :10 5; 7 :10 6;8 :10 7;9 :Marker 1〇
[0020] 图4实际样品检测电泳图。1 :阴性对照；2-4为1号鱼组织：体表肌肉、体表肌肉、 腹部肌肉；5-7为3号鱼组织：体表肌肉、体表肌肉、腹部肌肉；8-10为2号鱼组织：体表肌 肉、体表肌肉、腹部肌肉；11 :Marker I。
【具体实施方式】
[0021] 一、实验材料和仪器
[0022] 1. 1细菌菌株
[0023] 无乳链球菌（通威动物保健研究所分离、保存）、海豚链球菌（四川农业大学分离， 通威动物保健研究所保存）、荧光假单胞菌（中科院水生所，56-12-10)、嗜水气单胞菌（四 川农业大学分离，通威动物保健研究所保存）、柱状黄杆菌（中科院水生所G4)、标准豚鼠气 单胞菌（中科院水生所，DMA1-A)、沙门氏菌（ATCC 13311)、芽孢杆菌（CICC 1. 126)、温和 气单胞菌（ATCC 43979)、嗜麦芽寡养单胞菌（四川农业大学分离，通威动物保健研究所保 存）、爱德华氏菌（ATCC 33202)、副溶血弧菌（CICC 10552)。
[0024] 1. 2主要仪器和试剂
[0025]普通 PCR 仪（Mycycler，Bio-RAD)、凝胶呈像系统（universal H00D-SN，北京 六一）、高速台式冷冻离心机（KDC-160HR，科大创新）、电泳仪（Power PAC 3000，Bi〇-RAD)、 电热恒温摇床（SKY-211B，上海苏坤）、微量进样器（10yL、100yL、200 yL、1000 yL， Eppendorf)、超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化）、电热恒温培养箱（SPX-150B，上海浦东荣 丰）。
[0026] 细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；2XPCR MIX(天根生化科 技有限公司）、Greenview (Bio BRK)、琼脂糖（Sigma)〇
[0027] 实施例1引物设计
[0028] 一、实验方法
[0029] 1、PCR引物设计与合成
[0030] 根据弧菌属细菌共有的rpoA基因序列以及鮰爱德华氏菌磷酸丝氨酸转氨酶基因 序列，分别设计两对引物（表1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0031] 表1PCR引物资料
[0032]
[0033] 2、模板制备
[0034] 活化爱德华氏菌、副溶血弧菌，并使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组 DNA提取试剂盒提取。
[0035] 3、PCR 扩增
[0036] 以步骤2提取的DNA作为模板，阴性对照的模板为ddH20,取步骤1中的两对引物 按照下列体系和程序分别扩增：
[0037] PCR 反应体系（20 y 1):
[0038]
[0039] PCR反应程序：
[0040] 混匀PCR反应体系后，置于PCR仪中，95°C预变性4min后，进行如下循环：
[0041] 94 °C 30sec
[0042] 58 °C 30sec
[0043] 72 °Clmin
[0044] 35个循环，最后72°C延伸5min。
[0045] 4、结果检测
[0046] 采用1. 5%的琼脂糖凝胶，在恒压100V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观 察PCR扩增结果。
[0047] 二、结果
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