048] 结果如图1所示，空白对照无扩增条带，以爱德华氏菌DNA为模板时，可以扩增出 124bp大小的片段，以副溶血弧菌DNA为模板时可以扩增出524bp大小的片段，以爱德华氏 菌和副溶血弧菌的混合物为模板时，可以同时扩增储524bp、124bp大小的片段，与预期结 果一致（如图1)。
[0049] 实验证明，本发明SEQ ID NO. 1~2以及SEQ ID N0. 3~4所示引物对可以分别 同时准确扩增弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的基因，且两对引物之间没有相互干扰。
[0050] 实施例2引物特异性试验
[0051] -、试验方法
[0052] 1、PCR 引物
[0053] 取实施例1中表1所示两对引物。
[0054] 2、模板制备：
[0055] 分别取无乳链球菌、海豚链球菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、标准 豚鼠气单胞菌、柱状黄杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、温和气单胞菌的基因组DNA作模板，使用 天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。
[0056] 3、PCR 扩增
[0057] 分别取步骤2得到的基因组DNA作模板，阴性对照的模板为ddH20，以2. 5y1爱德 华氏菌DNA与2. 5 y 1副溶血弧菌DNA的混合物作为阳性模板，按照实施例1中扩增程序进 行扩增。
[0058] 4、结果检测
[0059] 采用1. 5%的琼脂糖凝胶，在恒压100V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观 察PCR扩增结果。
[0060] 二、结果
[0061] 结果如图2所示，除阳性样品（爱德华氏菌及弧菌）扩增出524bp、124bp大小的 靶标条带外，其余测试菌株无乳链球菌、海豚链球菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、柱状黄 杆菌、标准豚鼠气单胞菌、柱状黄杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、温和气单胞菌、嗜麦芽寡养单 胞菌均无条带。
[0062] 实验证明，本发明提供的检测试剂盒和方法特异性强，可以同时准确地扩增弧菌 属细菌和鮰爱德华氏菌的基因，而不会扩增其他细菌。
[0063] 实施例3引物灵敏度试验
[0064] 一、试验方法
[0065] 1、PCR 引物
[0066] 取实施例1中表1所示两对引物。
[0067] 2、模板制备：
[0068] 取阳性样品DNA(2. 5y1爱德华氏菌DNA与2. 5y1副溶血弧菌DNA的混合物），进 行浓度测定，并按照原浓度的10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、1〇 8、10 9倍进行倍比稀释。
[0069] 3、PCR 扩增
[0070] 分别取步骤2得到的基因组DNA作模板，阴性对照的模板为ddH20，按照实施例1 中扩增程序进行扩增。
[0071] 4、结果检测
[0072] 采用1. 5%的琼脂糖凝胶，在恒压100V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观 察PCR扩增结果。
[0073] 二、结果
[0074] 如图3所示，按照原浓度10 3进行倍比稀释时，仍然可以有效检测。也就是说，采 用建立的方法进行PCR扩增，能检测到爱德华氏菌和副溶血弧菌的核酸的最低模板浓度分 别为 8. 333ng/ y 1 和 20. 825ng/ y 1。
[0075] 实验证明，本发明提供的检测试剂盒和方法灵敏度高，可以检测到爱德华氏菌和 副溶血弧菌的核酸的最低模板浓度分别为8. 333ng/ y 1和20. 825ng/ y 1。实施例4实际 样本的检测
[0076] 一、实验方法
[0077] 待检样本：选取三条送检的斑点叉尾鮰（采自乐山），其中两条为病鱼，它们有明 显症状（体表有溃烂灶，腹部充血），编号为1、2;另一条为健康与，无明显症状，编号为3。 取1、2号鱼的肌肉3处（体表溃烂2处、腹部充血1处），取3号鱼的肌肉3处（体表肌肉 2处，腹部肌肉1处）。
[0078] 1、PCR检测
[0079] (l)PCR引物
[0080] 取实施例1中表1所示两对引物。
[0081] (2)模板制备
[0082] 利用chelex-100完成所取组织DNA的提取，并以此为模板进行PCR检测。
[0083] (3)PCR扩增
[0084] 分别取上述DNA作为模板，阴性对照的模板为ddH20，按照实施例1中扩增程序进 行扩增。
[0085] (4)结果检测
[0086] 采用1. 5%的琼脂糖凝胶，在恒压100V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观 察PCR扩增结果。
[0087] 二、结果
[0088] 如图3所示，结果显示，送检的斑点叉尾鮰1、2号均检出弧菌、鮰爱德华氏菌，而3 号未检测靶标病原，与实际情况一致。
[0089] 实验结果说明，本发明试剂盒和方法可以准确检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌。
[0090] 综上，本发明试剂盒和方法可以同时分别扩增弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的基因 片段，实现了在同一反应体系中一步检测两种病原菌，特异性强、灵敏度高、耗时短，步骤简 单，工作量下，成本低廉，用于快速检测养殖水体，可及时有效地预防鱼病的发生，具有良好 的应用前景。
【主权项】
1. SEQ ID NO. 1~2与SEQ ID NO. 3~4所示的引物对。 2. SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID NO. 3~4所示的引物对在制备同时检测弧菌属细菌和 鮰爱德华氏菌的试剂中的用途。3. -种同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID NO. 3~4所示的引物对。4. 一种同时检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的方法，其特征在于：它包括如下步骤： (1) 提取样本DNA :取待检样本，提取其中的DNA ; (2) 基因扩增：用权利要求4所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增； (3) 结果检测：对DNA扩增结果进行检测。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述待检样本为养殖水体。
【专利摘要】本发明公开了SEQ？ID？NO.1～2与SEQ？ID？NO.3～4所示的引物对及其用途，本发明还公开了检测弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒和检测方法。本发明试剂盒和方法可以同时分别扩增弧菌属细菌和鮰爱德华氏菌的基因片段，实现了在同一反应体系中一步检测两种病原菌，特异性强、灵敏度高、耗时短，步骤简单，工作量下，成本低廉，用于快速检测养殖水体，可及时有效地预防鱼病的发生，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/01
【公开号】CN105132411
【申请号】CN201510349562
【发明人】刘衍鹏, 刘天强, 黄冠军, 敬小兵, 王浩丞
【申请人】通威股份有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年6月23日