一种用于木材加工的果胶酶的制作方法
【技术领域】
:
[0001]本发明涉及一种用于木材加工的果胶酶，属于生物发酵工程技术领域。
【背景技术】
:
[0002]果胶酶是指能分解果胶质的一类酶的总称，适于木材加工用果胶酶是指可以有效的作用于木材，在木材特有的酸碱环境(PH为5.0-6.0)范围内可以有效发挥作用的一类果胶酶。果胶酶主要用于饮料、葡萄酒等食品工业，但随着环境污染的日益严重，生物制浆、生物分离纤维和生物纺织等日益受到了重视和关注，但目前市场上的果胶酶多为食品加工专用的酸性果胶酶和针对纺织工业而研制的碱性果胶酶。木质材料不仅具有自己特殊的化学成分，均可对生物酶产生抑制作用，还有自己特有的酸碱环境，也会对生物酶产生不利影响。内生菌是一种，完全适应植物内部酸碱环境和化学成分的一类特殊的微生物，其在漫长的进化过程中与其宿主植物协同进化，所以从植物内生菌中筛选出可以适应植物内部环境，应用于木材加工的高效果胶酶。另一方面，果胶质是陆生植物中的关键物质，分布于细胞的胞间层和初生细胞壁中，和无机盐Ga2+形成了螯合物，组成了类似于“蛋壳”的结构，对细胞壁的发育起着支撑作用，在细胞发育成熟后又与纤维素、半纤维素和木质素等形成了复杂的化学键。由于果胶质的存在，当木质材料用于制浆造纸、纺织、纤维分离、酒精制备、纳米纤维素制备时均增加了难度。
[0003]本发明提供的用于木材加工的果胶酶，经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的在于克服现有技术之不足，而是提供一种完全适应植物内部环境、用于木材加工的果胶酶。
[0005]本发明的技术方案:
[0006]本发明的一种用于木材加工的果胶酶，经如下步骤得到:
[0007]a.出发菌株:土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)HS021，保藏编号CCTCC M2015031 ;保藏时间:2015年I月11日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国、武汉、武汉大学。
[0008]b.种子菌体培养
[0009]种子培养基组成:以g/1000ml计，果胶4g，酵母粉4g，麦芽粉3g，琼脂粉14g，用蒸馏水配至1000ml，用灭菌锅在121°C条件下灭菌30min后，用倾斜法倒至经灭菌锅121°C条件下灭菌60min并已干燥的培养皿中；
[0010]种子菌体培养:待种子培养基冷却，将菌体用竹签接种于培养皿的种子培养基上，在30_37°C培养箱中培养24小时，用于种子菌体的培养；
[0011]c.发酵培养
[0012]发酵培养基的组成，以g/1000ml计，果胶酶底物0.4g，葡萄糖3.6g，酵母粉4g,麦芽粉3g, MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g用蒸馏水配至1000ml，利用0.01% HCl调pH值至6.0 ;后分装于250ml的锥形瓶中，每瓶装200ml的培养基，在121°C条件下灭菌30min，待培养基冷却至室温后；将13步骤的菌龄为24h的菌体，用竹签接种I环至发酵培养基中，在摇床温度30-37°C、转速200r/min，发酵24h得到果胶酶的粗酶液；将果胶酶粗酶液利用离心机和超滤膜初步分离纯化后，利用常规DNS法进行果胶酶酶活的测试。
[0013]发酵培养基中的果胶酶底物为:果胶、或柚子粉、或木粉、或麸皮粉、或大麻杆粉。
[0014]本发明的用于木材加工的果胶酶，其性能参数为:最适使用温度为50°C，最适pH值为4.5-6.0 ;在温度4°C或以下温度储存，储存时间为24-72h ;储存在37°C或60°C时储存，储存时间为24h。
[0015]本发明的优点在于:
[0016]1、利用完全适应植物内部环境的内生菌为出发菌株，制备出在pH值4.5-6.0环境能够充分发挥果胶酶活性的果胶酶溶液，对于实现、促进木质材料的生物加工奠定基础。
[0017]2、能高效用于木材加工的果胶酶，对于实现生物制浆、绿色纤维分离和生物纺织均具有一定的推动和促进作用。
【具体实施方式】
:
[0018]实施例1:
[0019]本发明的一种用于木材加工的果胶酶，经如下步骤得到:
[0020]a.出发菌株:土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)HS021，保藏编号CCTCC M2015031 ;保藏时间:2015年I月11日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国、武汉、武汉大学。
[0021]b.种子菌体培养
[0022]种子培养基组成:以g/1000ml计，果胶4g，酵母粉4g，麦芽粉3g，琼脂粉14g，用蒸馏水配至1000ml，用灭菌锅在121°C条件下灭菌30min后，用倾斜法倒至经灭菌锅121°C条件下灭菌60min并已干燥的培养皿中；
[0023]种子菌体培养:待种子培养基冷却，将菌体用竹签接种于培养皿的种子培养基上，在30°C或33°C或37°C培养箱中培养24小时，用于种子菌体的培养；
[0024]c.发酵培养
[0025]发酵培养基的组成，以g/1000ml计，果胶0.4g，葡萄糖3.6g，酵母粉4g,麦芽粉3g, MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g 用蒸馏水配至 1000ml，利用 0.01% HCl 调 pH 值至 4.5 或 5.0 或6.0 ;后分装于250ml的锥形瓶中，每瓶装200ml的培养基，在121°C条件下灭菌30min，待培养基冷却至室温后；将b步骤的菌龄为24h的菌体，用竹签接种I环至发酵培养基中，在摇床温度30°C或33°C或37°C、转速200r/min，发酵24h得到果胶酶的粗酶液；将果胶酶粗酶液利用离心机和超滤膜初步分离纯化后，利用常规DNS法进行果胶酶酶活的测试，果胶酶酶活(u/ml)为 17.67 ±0.3。
[0026]本发明的用于木材加工的果胶酶，其性能参数为:最适使用温度为50°C，最适pH值为4.5-6.0 ;在温度4°C或以下温度储存，储存时间为24-72h ;储存在37°C或60°C时储存，储存时间为24h。
[0027]实施例2:
[0028]基本同实施例1。不同之处为:发酵培养基中的果胶酶底物为柚子粉。利用常规DNS法进行果胶酶酶活的测试，果胶酶酶活(u/ml)为5.93±0.3。
[0029]实施例3:
[0030]基本同实施例1。不同之处为:发酵培养基中的果胶酶底物为木粉。利用常规DNS法进行果胶酶酶活的测试，果胶酶酶活(u/ml)为4.92±0.3。
[0031]实施例4:
[0032]基本同实施例1。不同之处为:发酵培养基中的果胶酶底物为工业大麻杆粉。利用常规DNS法进行果胶酶酶活的测试，果胶酶酶活(u/ml)为7.04±0.3。
[0033]实施例5:
[0034]基本同实施例1。不同之处为:发酵培养基中的果胶酶底物为麸皮粉。利用常规DNS法进行果胶酶酶活的测试，果胶酶酶活(u/ml)为2.49±0.3。
[0035]发明人将上述实施例得到的果胶酶，用常规DNS法在不同温度、不同pH值、不同储存温度下测试果胶酶的酶活，得到果胶酶的性能参数为:最适使用温度为50°C、最适pH值为4.5-6.0、在温度4°C或以下温度储存，储存时间为24-72h ;储存在37°C或60°C时储存，储存时间为24h。
【主权项】
1.一种用于木材加工的果胶酶，其特征在于该果胶酶经如下步骤得到: a.出发菌株:土壤短芽孢杆菌(Brevibacillusagri)HS021，保藏编号CCTCC M2015031 ； b.种子菌体培养 种子培养基组成:以g/1000ml计，果胶4g，酵母粉4g，麦芽粉3g，琼脂粉14g，用蒸馏水配至1000ml，用灭菌锅在121°C条件下灭菌30min后，用倾斜法倒至经灭菌锅121°C条件下灭菌60min并已干燥的培养皿中； 种子菌体培养:待种子培养基冷却，将菌体用竹签接种于培养皿的种子培养基上，在30-37°C培养箱中培养24小时，用于种子菌体的培养； c.发酵培养 发酵培养基的组成，以g/1000ml计，果胶酶底物0.4g，葡萄糖3.6g，酵母粉4g,麦芽粉3g, MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g用蒸馏水配至1000ml，利用0.01% HCl调pH值至6.0 ;后分装于250ml的锥形瓶中，每瓶装200ml的培养基，在121°C条件下灭菌30min，待培养基冷却至室温后；将13步骤的菌龄为24h的菌体，用竹签接种I环至发酵培养基中，在摇床温度30-37°C、转速200r/min，发酵24h得到果胶酶的粗酶液；将果胶酶粗酶液利用离心机和超滤膜初步分离纯化后，利用DNS法进行果胶酶酶活的测试； 发酵培养基中的果胶酶底物为:果胶、或柚子粉、或木粉、或麸皮粉、或大麻杆粉。2.权利要求1所述的用于木材加工的果胶酶，其特征在于该果胶酶的性能参数为:最适使用温度为50 °C、最适pH值为4.5-6.0、在温度4 °C或以下温度储存，储存时间为24-72h ;储存在37°C或60°C时，储存时间为24h。
【专利摘要】本发明涉及一种用于木材加工的果胶酶，属于生物发酵工程技术领域。本发明利用保藏编号CCTCC？M2015031的土壤短芽孢杆菌？（<i>Brevibacillus？agri</i>）HS021，通过种子菌体培养、发酵培养得到用于木材加工的果胶酶。本发明的优点在于：1、利用完全适应植物内部环境的内生菌为出发菌株，制备出在pH值4.5-6.0环境能够充分发挥果胶酶活性的果胶酶溶液，对于实现、促进木质材料的生物加工奠定基础。2、能高效用于木材加工的果胶酶，对于实现生物制浆、绿色纤维分离和生物纺织均具有一定的推动和促进作用。CCTCC NO:M201503120150111
【IPC分类】C12N9/26, C12R1/01, C12N9/88, C12N9/18
【公开号】CN105132401
【申请号】CN201510448404
【发明人】邹成钢, 李晓平, 乔敏, 吴宁, 王齐玮, 肖瑞
【申请人】云南大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月28日