一种提高豆粨降解效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种提高豆栢降解效率的方法。
【背景技术】
[0002] 豆柏是大豆提取豆油后得到的一种副产品，是棉籽柏、花生柏、菜籽柏等动植物油 柏饲料产品中产量最大，用途最广的一种。作为一种高蛋白质，豆柏是制作牲畜与家禽饲料 的主要原料，大约85%的豆柏被用于家禽、水产养殖动物的饲料。
[0003] 但消化酶系统尚未发育完全的幼畜（特别是对于早期断奶的动物）会对豆栢中 存在的抗营养因子产生过敏反应，对以豆栢作为植物蛋白来源的饲料消化能力较弱。而营 养拮抗因子的存在也是影响大豆蛋白源在饲料中使用的主要因素。而大豆肽中富含许多 小肽，能直接被动物吸收，而且大豆肽抗原性较低，幼畜使用后发生过敏反应的概率大大降 低。研究表明在早期断奶子猪饲料中添加大豆肽作为血浆蛋白粉的替代品，其日均增质量 率、饵料系数、特定生长率等无显着性差异。但目前使豆柏降解为易吸收的小肽的过程中还 存在水解效率较低的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种提高豆栢降解效率的方法，有效的提供豆栢的酶解效 率。
[0005] 为了提高碱性蛋白酶对豆栢的降解效率（以水解度作为评价标准），申请人对碱 性蛋白酶的序列进行改造，获得了能高效降解豆栢为多肽的碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶的 氨基酸序列为SEQ ID N0:4,其一种编码基因的序列为SEQ ID N0:3。
[0006] 本发明还提供一种重组的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，是将携带有上述 编码基因的重组质粒转化后制备的；
[0007] 另一方面，申请人用该重组的枯草芽孢杆菌来发酵豆栢。
[0008] 本发明使用优化后的碱性蛋白酶来制备重组枯草芽孢杆菌，从而再更短的时间内 对豆栢发酵完全，从而有效的提高了发酵效率，节省了成本。
【具体实施方式】
[0009] 本发明所述的蛋白水解度（Degreeofhydrolysis, DH)是指蛋白质中的肽键被水 解的百分数，其计算公式如下：
[0010] DH%= h/htotx100 %
[0011] h是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的妝键的晕摩尔数（mmlo/g蛋白质）、
[0012] htat，以酪蛋白为标准，其值为8. 2mmlo/g蛋白质；
[0013] 当蛋白质的肽键全部被水解生成游离的氨基酸时，则水解度为100% ;没有被水解 时，其水解度为0。由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就新生成一个_NH2和一个-C00H基， 因此，在测定蛋白质的水解度时，只要定量的测定新生成的的_順2和-C00H基量就可以计 算h值；这样就可以算出蛋白质的水解度来。
[0014] 本发明采用甲醛固定法来测定h值（中华人民共和国国家标准甲醛值法 GB12143. 2-89)〇
[0015] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0016] 实施例1碱性蛋白酶的优化
[0017] 1、利用易错PCR的技术在体外向核苷酸序列为SEQIDNO: 1的碱性蛋白酶基因 (编码的成熟肽氨基酸序列为SEQIDN0:2)中引入核苷酸突变，易错PCR的体系如下：
[0018] 10XPCR Buffer (不含 MgCI2)5yL，dCTP(25mmol/L)2yL，d!TP(25mmol/L)2yL， dGTP(10mmol/L) 1 y L, dATP (lOmmol/L) 1 y L, F (lOpmol/y L) 1 y L, R (lOpmol/y L) 1 yL, Mg2+ (20mM) 14 y L，Mn2+ (3mM) 1. 5 y L，pQC670. 5 y L，Taq DNA polymerase (2. 5U) 1 y L，ddH20 20 y L〇
[0019] ：5r -tagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaat-3'
[0020] 下游引物：5' -atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta-3'；
[0021] 扩增条件为：94°C lOmin ;94°C 60s，58°C 60s，72°C 2min，30 个循环；72°C 10min。 利用Gel Extraction Kit回收突变体PCR扩增产物。
[0022] 2、扩增得到的突变产物与表达载体连接 [0023] 以PQC67质粒为模板，利用
[0024] 上游引物：tgcagaagcggcaacacgctaaattaagcatgcaagctagttgc
[0025] 和下游引物 atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta 作为引物进行 PCR扩增，获得载体基因序列。扩增条件为：98°C lOmin ;98°C 10s，55°C 20s，72°C 3min，30 个循环；72°C lOmin。利用Gel Extraction Kit回收PCR扩增产物。
[0026] 将回收的突变体PCR扩增产物和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体 系如下：5XPhusionHFBuffer10iiL，2.5mMdNTPs8tiL，Insertgene(aprE片段）4uL， Linearizedvector(pQC67)6iiL，PhusionDNAPolymeraselyL，ddH20 21yL。扩增条件 为98。(：1〇1^11;98。(：1〇8,721€3111111，20个循环 ；98。(：1〇8,721€6111111，15个循环；72。(：1〇111111。
[0027] 将多聚体转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，得到阳性转化子，即为能表达碱 性蛋白酶突变体的重组菌株（实验菌株）。同时以序列为SEQ ID N0:2的碱性蛋白酶基因 (野生型）构建后作为对照菌株。
[0028] 3、碱性蛋白酶突变体的筛选
[0029]无菌条件下将步骤2中获得的重组菌株分别接种于加入50mL培养基试管中（种 子培养基的组成为〇. 5 %的酵母粉，1 %胰蛋白胨，1 %葡萄糖，1. 8 % K2HP04，麦芽糊精5~ 10 %，柠檬酸钠 〇? 1 ~〇? 5 %，CaCl20.1 ~0? 5 %，MgS040. 1 ~0? 5 %，K2HP040.5 ~2 % ) 中，34°(：、210印111振荡培养811;然后再加入3〇1111浓度为12%的大豆分离蛋白容易（5?1溶 液），于34°C、250rpm振荡培养36h ;然后进行离心，获得的上清液测定水解度值DH，从而筛 选出对大豆蛋白粉降解能力增强的重组菌株。最终筛选出2个对大豆蛋白粉降解能力明 显增强的重组菌株（相比于对照株，），命名为8 &以111^-&和8&(^111^-13，其中重组菌株 Bacillus-a的DH值为12、重组菌株Bacillus-b的DH值为17,而对照菌株的DH值为8。 但绝大部分的重组菌株与对照菌株的水解度没有差别，且有的重组菌株的DH值比对照菌 株降低；重复实验的结果也相同。
[0030] 实施例2筛选出的菌株中碱性蛋白酶序列的确定
[0031] 利用质粒提取试剂盒分别提取Bacillus - a和Bacillus - b菌株中的质粒；由上 海生工公司对上述质粒分别进行基因测序。测序结果显示：Bacillus - a菌株中的质粒携 带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:3,其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:4， 命名为Ba-enzyme ;枯草芽孢杆菌Bacillus - b中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸 序列为3￡〇10勵:5，其编码的氨基酸序列为3￡〇10勵:6，命名为他-61^ 71116。对序列比 较发现，Bacillus-a获得的碱性蛋白酶Ba-enzyme的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)与野生 型的碱性蛋白酶SEQ ID N0:2相比，第41位氨基酸由Leu突变为Ser，第101位氨基酸由 Ser突变为Leu ;第201位氨基酸由Ser突变为ASN。而Bb-enzyme的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)与野生型的碱性蛋白酶SEQ ID N0:2相比，第65位氨基酸由His突变为Leu，第125 位氨基酸由Gly突变为Val，第148位氨基酸由Val突变为Leu ;第205位氨基酸由Gly突 变为Val。
[0032] 同时，申请人也与对照菌株的水解度没有差别，以及比对照菌株降低的重组菌株 中的碱性蛋白酶的序列进行分析，结果发现，其中有些菌株的碱性蛋白酶与原始的碱性蛋 白酶序列相比也存在一个或多个氨基酸的突变。
[0033] 实施例3 :Ba_enzyme、Bb-enzyme酶重组表达后酶学性质分析
[0034] 将携带能Ba-enzyme、Bb-enzyme菌株，以及对照菌株进行诱导表达，纯化后获得 Ba-enzyme和Bb-enzyme，以及对照组的重组碱性蛋白酶，按照如下的方法进行水解度检 测：
[0035] 配制浓度为4% (w/v)的SPI溶液各200mL于50°C预处理lOmin，在50°C、pH10. 0 条件下加入Ba-enzyme、Bb-enzyme和对照的原始碱性蛋白酶各5g进行酶解，酶解40min进 行水解度的测定，设置3个平行样，取平均值。结果表明，对照的原始碱性蛋白酶的DH值为 14, Ba-enzyme的DH值为22,而Bb-enzyme的DH值为26,表明突变的酶比原始酶具有更好 的效果。
[0036] 同时对Ba-enzyme、Bb-enzyme的酶活进行了测定，采用中华人民共和国国家标准 蛋白酶制剂测定方法（GB/T 25327-2009)。运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液 包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42. 4g/L)，三 氯乙酸（65. 4g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0 g/L)。反应过程如下：试管中加入 lmL酶液，40°C温浴2min，加入酪蛋白溶液lmL，摇匀后40°C温浴lOmin，加入2mL三氯乙酸 溶液，摇匀（空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止lOmin，慢速定性 滤纸过滤。取lmL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液lmL，40°C显色20min，于 680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。结果表明Bb-enzyme的酶活高于Ba-enzyme，与水 解度的结果一致。
[0037] 将Ba-enzyme和Bb-enzyme菌株来发酵豆栢，豆柏粉碎至40目以下，豆柏和水按 1 :1. 5的比例混合，然后在混合物中接种菌株，在35°C的条件下发酵36小时，同时用阳性对 照株接种进行发酵。发酵后检测粗蛋白、三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI)含量、胰蛋白酶抑制 因子和尿素酶活性。结果表明，相比于阳性对照菌，Ba-enzyme和Bb-enzyme菌株可以在更 短的时间内使发酵豆栢达到作为饲料添加剂的使用要求，从而有效的节省了成本，发酵后 产物用于制备饲料组分。
【主权项】
1. 一种碱性蛋白酶，其特征在于，所述的碱性蛋白酶包含有： 1) 氨基酸序列为SEQ ID NO:4的碱性蛋白酶； 2) 与1)的碱性蛋白酶具有95%或以上同源性，且具有碱性蛋白酶活性的蛋白酶。2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的碱性蛋白酶。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的序列为SEQ ID N0:3。4. 一种重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，是将携带有权利要求2所述的基因 的重组质粒转化后制备的。5. -种豆栢的发酵方法，其特征在于，所述的发酵方法是用权利要求4所述的重组枯 草芽孢杆菌来发酵的。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种提高豆粨降解效率的方法，有效的提供豆粨的酶解效率。为了提高碱性蛋白酶对豆粨的降解效率，提供一种能高效降解豆粨为多肽的碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:4，其一种编码基因的序列为SEQ？ID？NO:3。本发明使用优化后的碱性蛋白酶来制备重组枯草芽孢杆菌，从而再更短的时间内对豆粨发酵完全，从而有效的提高了发酵效率，节省了成本。
【IPC分类】A23K1/16, C12N15/57, C12N9/54, C12N15/75, C12R1/125, C12N1/21
【公开号】CN105132397
【申请号】CN201510555686
【发明人】孙翠言, 张培, 类延乐
【申请人】孙翠言
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月5日