一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、 嗜热碱性果胶裂解酶及该酶在降解果胶物质中的应用。
【背景技术】
[0002] 果胶物质主要由多聚半乳糖醛酸(GalA)组成，并且侧链还常带有海藻糖、鼠李糖、 阿拉伯糖等，广泛存在于植物初生细胞壁中。
[0003] 果胶酶是一系列分解果胶物质的酶类的总称，在高等植物和微生物中分布甚广。 植物在成熟过程中，果胶酶使植物细胞壁更松软，对植物组织腐败再生平衡也起到了重要 作用。果胶酶按其作用方式的不同可分为两大类，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分为水解酶 和裂解酶。水解酶是通过引入水分子水解糖苷键，而裂解酶是通过反式消去作用断裂糖苷 键。
[0004] 果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁并导致植物组织 软化甚至死亡的解聚酶，它在果胶降解过程中起着重要的作用。其作用机制是通过消旋 的方式作用于断裂糖苷键，形成3 4,5不饱和双键，产生不饱和的半乳糖醛酸寡聚糖。果胶裂 解酶也是麻料脱胶工艺和纺织工艺中不可缺少的主要酶类。在医药、生物技术、饲料加工、 环保方面也具有相当地位，在木材防腐和造纸等方面也应用广泛。
[0005] 目前果胶裂解酶主要以碱性酶为主，而且大多是常温酶，嗜热酶较少，迄今为止， 关于嗜热纤维素酶的报道很多，而关于嗜热果胶酶的报道很少。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的是提供一种Caldicellulosiruptor bescii基因来源的嗜热碱 性果胶裂解酶工程菌以及构建方法，所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b( + )-PelC，其保藏编号为CGMCCNo.ll460，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期为 2015年9月29日。
[0007] 工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋 白，进行分离纯化得到嗜热蛋白，即嗜热碱性果胶裂解酶。
[0008] 本发明制备的嗜热碱性果胶裂解酶的产量可达到50mg/L (1L发酵液），相对现有国 内筛选到的碱性果胶酶，是一种效价很高的碱性果胶酶，为进一步实现工业化铺垫，也为工 业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。
[0009] 本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌以源于热梭杆菌 Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因为模板，设计引物，通过PCR反应扩增3'端 含有6个组氨酸标签的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 测序谱图如图1所示。将该嗜热碱性果胶裂解酶基因 Peic连接到表达载体pET20b( + )上获得 重组表达载体，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中得到嗜热碱性果胶 裂解酶工程菌。
[00?0] 本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌的构建方法参见文献:Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach .2011,Shuying Fang，Jianghua Li ,Long Liu, Guocheng Du，Jian Chen.Volume 102，Issue 22，November 2011，Pages 10671-10678。具 体步骤如下：
[0011] (1)以热梭杆菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725全基因组DNA为模板，设 计引物，通过PCR反应扩增得到3 '端含有6个组氨酸标签基因的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基 因；
[0012] (2)将步骤（1)得到的嗜热碱性果胶裂解酶基因 Pe 1C酶切后与pET20b (+)表达载体 连接，得到重组表达载体pET20b (+) -Pe 1C;
[0013] (3)将重组表达载体pET20b( + )-pelC转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)中，构建得到本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)/pET20b(+)-PelC〇
[0014] PCR引物，包括上游引物和下游引物，
[0015] 上游引物：5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'，
[0016] 下游引物：5，CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3，，
[0017] 上游引物5 '端CATATG为NdeI酶切位点，保护碱基GGAATTC;下游引物5 '端CTCGAG为 Xholl酶切位点，保护碱基CCG。
[0018] 所述的重组表达载体pET20b( + )_PelC是将嗜热碱性果胶裂解酶基因 PelC插入到 表达载体pET20b (+)的Nde I和Xho 11位点间得到。
[0019] 所述工程菌是将重组表达载体导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)得到的。
[0020] 本发明的第二个目的是提供一种应用本发明所述的工程菌发酵生产的嗜热碱性 果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。其是将嗜热碱性果胶裂解酶工程菌接种 (接种量2%〇~5%〇(v/v))至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，37°C、170r/min振荡培养 至OD6〇q = 6.0，获得种子液;然后将种子液接种至含有50yg/mL氨节的发酵培养基中，接菌量 为2%。~5%。(v/v)，装液量为2L/5L(2L指的是发酵培养液体积，5L指的是锥形瓶的容积），于 37°C、170r/min振荡培养至0D 6q() = 0.6时加入终浓度0.5mM IPTG进行诱导，同时将温度调整 为25~28°C，转速调整为100~120r/min，诱导发酵18~24h，从而得到工程菌发酵液。将细 胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，通过镍柱亲和层析法得到嗜热碱性果胶裂解酶。经 过镍柱纯化处理后嗜热碱性果胶裂解酶含量可达到50mg/L( 1L发酵液）。
[0021] 在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终 浓度分别为:胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L;培养基的pH值为7.0-7.2;发酵 培养基的成份如下:培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度为:胰蛋白 胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L;培养基的pH值为7.0~7.2;
[0022] 本发明的第三个目的是提供所述的嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应 用。
[0023]在本发明应用中，所述果胶物质为多聚半乳糖醛酸。
[0024] 本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶，在70°C降解多聚半乳糖醛酸的酶活为900U/mg; 热稳定较好，在70°C保温下，半衰期为6h;最适反应温度为70°C，最适Ca2+浓度为0.8mM，底物 为0.2% (w/v)pH = 9.5。本发明所提供的工程菌中嗜热碱性果胶裂解酶发酵量比野生菌株 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725有大幅度的提高，更加适应工业化生产需求，为 工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。
【附图说明】
[0025]图1为嗜热碱性果胶裂解酶基因测序谱图（分为图1(a)和图1(b)两部分）。
[0026]图2为嗜热碱性果胶裂解酶SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，1道是Marker，2道透析后 溶液中的蛋白。
[0027] 图3为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的最适pH曲线。
[0028] 图4为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的最适反应温度曲线。
[0029 ]图5为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的最适Ca2+浓度曲线。
[0030]图6为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的热稳定性曲线。 具体实施方案
[0031 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。
[0032]下述实施例中所使用的耗材、试剂、仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0033]下述实施例中蛋白含量的测定使用的仪器为Nano Drop微型分光光度计检测蛋白 浓度。
[0034]实施例1:嗜热工程菌的构建及酶的表达
[0035] (1)引物设计及用PCR方法获取嗜热碱性果胶裂解酶基因 PelC
[0036] 以热梭杆菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因组为模板，设计引物， 通过PCR方法扩增PelC基因，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1300bp，测序表明， 该片段的大小为1305bp，其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0037]上游引物的序列如下：
[0038] 上游引物1:
[0039] 5 ' GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3，
[0040](下划线碱基为Ndel酶切识别序列）；
[0041]下游引物的序列如下：
[0042]下游引物2:
[0043] 5 ' CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'
[0044](下划线碱基为Xholl酶切识别序列）。
[0045] PCR反应体系如下：（引物浓度为20ymol/L)
[0046]
[0047] PCR 反应条件:94°C 预变性 lOmin，94°C 变性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 2min，30 个 循环后72°C延伸10min，4°C保存，得到序列表序列所示的DNA片段。将序列表序列的DNA片 段，用Ndel和Xholl双酶切，与经过Ndel和Xholl双酶切的载体pET20b( + )的骨架片段进行过 夜连接，获得重组载体pET20b( + )-PelC，经过测序证实，重组载体为在载体pET20b( + )的Nde I和Xho 11位点间插入序列表序列。
[0048] 酶切体系如下（20yL):
[0049]
[0050] pET20b( + )-pelC(pET20b( + )购于EMD Biosciences(Novagen)公司）的构建方法参 考文献：Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011,Shuying Fang， Jianghua Li，Long Liu，Guocheng Du，Jian Chen.Volume 102,Issue 22,November 2011， Pages 10671-10678。
[0051 ] (2)制备工程菌
[0052]感受态细胞的制备：将E. coli BL21(DE3)在划线平板培养基上挑取单菌落，接种 到LB培养基中。37°C振荡培养。测定OD600值，当OD600值达到0.3时(大约培养3-4小时，此为实 验成功的关键）。取上述菌体培养液于50mL离心管中，冰上放置lOmindt离心10min (4000r/min)，倒出培养基，将管口倒置以便培养基流尽。用冰冷(4°C)的0. lmol/L CaCl2 10mL悬浮细胞沉淀，冰上放置30min。4°(3离心10min(4000r/min)。倒出上清液，用冰冷的 0.1mol/L CaCl22mL悬浮细胞沉淀(务必放在冰上）。分装细胞，加入预冷的含30%(v/v)甘 油，每管200yL分装，-80°C冰箱保存，此细胞为感受态细胞。本感受细胞可以直接用于DNA的 转化实验，也可以于-80°C冰箱保存，以备