一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，更具体地，本发明涉及一种褐藻胶裂解酶基因algp及 其制备方法与表达。
【背景技术】
[0002] 广轰无巧的海洋占据着地球71%的面积，是一个巨大的宝库，蕴藏的巨量的生物 资源。海藻是其中一种重要的海洋植物，它是无机物的天然富集器，也是许多海洋活性物质 的制造者。海藻多糖就是海藻中的一大类重要活性物质，目前国际上应用最广泛最多的海 藻多糖是褐藻胶，卡拉胶和琼胶。
[0003] 褐藻胶是源自于褐藻植物的细胞壁的水溶性酸性多糖，其主要由aA-古罗糖醒 酸和目-D-甘露糖醒酸组成。随着研究的发现，褐藻胶的降解产物具有特别的化学活性与 生物活性，在医药卫生、食品工业及化妆品行业等均存在巨大的应用价值。制备褐藻胶降解 产物有多种方法，如酸法降解、超声降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相较于化学 法制备反应温和、易于控制，耗能低，产物回收率较高W及不会产生严重的污染等优点，更 多的研究聚焦于酶法降法制备褐藻胶低聚糖。
[0004] 但是，目前由于大多数产褐藻胶裂解酶的菌株的活性较低，产量较低，阻碍了褐藻 胶低聚糖的制备，进一步阻碍了研究与应用的深入进展。
[0005] 因此，开发活性高、产量高的褐藻胶裂解酶、提高产褐藻胶裂解酶的菌株的活性成 为了本技术领域的当务之急。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种褐藻胶裂解酶，其是：
[000引 （a)SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列的多肤；或
[0009] 化）将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10 个；更佳地1-5个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肤活性的由（a) 衍生的多肤；
[0010] (C)氨基酸序列与（a)限定的多肤的氨基酸序列有90%W上（较佳地95%W上； 更佳地98%W上；更佳地99%W上）相同性且具有（a)多肤活性的多肤；或
[0011] (d)具有（a)多肤功能的SEQIDNO:2的蛋白片段。
[0012] 在一个优选例中，所述的褐藻胶裂解酶来源于海洋弧菌（VibrioSP.)QY102。
[0013] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核巧酸，该多核巧酸编码所述的褐藻胶 裂解酶的多核巧酸。
[0014] 在一个优选例中，所述的多核巧酸的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0015] 在本发明的另一方面，提供一种表达载体，它含有所述的多核巧酸。
[0016] 在一个优选例中，所述的表达载体来源于pet28。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基 因组中整合有所述的多核巧酸。
[0018] 在一个优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞，较佳地为大肠杆菌细胞，更佳地为 HMS174值E3)。
[0019] 在本发明的另一方面，提供所述的褐藻胶裂解酶的用途，用于酶解褐藻胶。
[0020] 在本发明的另一方面，提供一种生产褐藻胶裂解酶的方法，包括步骤：
[0021] (1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和
[0022] (2)从培养物中分离褐藻胶裂解酶。
[0023] 在一个优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞，所述的方法包括：
[0024] 使所述宿主细胞在化发酵罐中采用发酵培养基生长，生长到ODe。。= 3 + 0. 5时， 开始补稀料，根据溶氧反馈缓慢提升补料速率，待1+0.2L稀料补完换成浓料进行补料；整 个发酵过程控制溶氧在30 + 10% (较佳地30 + 5% );菌体生长到ODe。。= 40 + 3时暂停补 料，此时溶氧迅速回升，待停补料约IOmin后进行IPTG诱导，添加IPTG后维持30 ± 5min后 再进行补料，待菌体生长缓慢、酶活不再增长后停止发酵。
[00巧]在另一优选例中，所述的发酵培养基的组分为；酵母粉2g/l，甘油5g/l，泡敌 60U1/L，胞2册〇46g/L，KH2PO43g/L，畑典1Ig/L，化Cl0. 5g/L，M拆〇40. 5g/L，CaClz溶液 2ml/L，微量元素2ml/L;
[0026] 所述的稀料的组分为；蛋白腺20g/L，酵母粉lOg/L，甘油60g/L，M拆O4I. 25g/L;
[0027] 所述的浓料的组分为；蛋白腺80g/l，酵母粉40g/l，甘油240g/L，M拆〇45g/L;
[0028] 所述各组分的用量在所指定数值基础上可浮动±20% (较佳地，浮动±10% ;更 佳地，浮动±5% )。
[0029] 在本发明的另一方面，提供一种用于酶解褐藻胶的试剂盒，所述的试剂盒中包含 所述的褐藻胶裂解酶。
[0030] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0031] 图1、褐藻胶裂解酶基因al甜的核巧酸序列。
[0032] 图2、根据褐藻胶裂解酶基因algp的核巧酸序列推测的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0033] 本发明人经过长期的研究，首次掲示了一种海洋弧菌（VibrioSP.)QY102来源的 褐藻胶裂解酶，其编码基因命名为algp。本发明的褐藻胶裂解酶蛋白稳定性好，生物活性 高。本发明还公开了含有algp基因的表达载体和宿主细胞，W及表达该褐藻胶裂解酶的方 法。根据本发明的技术方案，可W实现W较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。
[0034] 如本文所用，所述的"褐藻胶裂解酶活性"是W酶的活力单位来定义的。酶活力单 位扣）定义为；在实验条件下，每分钟催化底物产生Iyg还原糖所需的酶量。发酵液酶活 力单位定义为；每毫升发酵液含酶活单位扣/ml)。
[0035] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核巧酸和多肤是没有分离纯化 的，但同样的多聚核巧酸或多肤如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。
[0036] 如本文所用，"分离的褐藻胶裂解酶或多肤（蛋白）"是指褐藻胶裂解酶基本上不 含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质 纯化技术纯化褐藻胶裂解酶。基本上纯的多肤在非还原聚丙帰醜胺凝胶上能产生单一的主 带。
[0037] 本发明的褐藻胶裂解酶多肤可W是重组多肤、天然多肤、合成多肤。本发明的多肤 可W是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从宿主（例如，细菌、酵母、 高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。
[0038] 本发明还包括褐藻胶裂解酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、 "衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的天然褐藻胶裂解酶相同的生物学功能或活 性的多肤。本发明的多肤片段、衍生物或类似物可W是（i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肤，而送样的取代的氨基酸残基可W是 也可W不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肤， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肤序列而形成的多肤（如前导序列或分泌序列或用 来纯化此多肤的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义送些片段、衍生物和类 似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0039] 在本发明中，术语"褐藻胶裂解酶"指具有裂解褐藻胶的活性的SEQIDNO:2序列 的多肤。该术语还包括具有与褐藻胶裂解酶相同功能的、SEQIDN0:2序列的变异形式。送 些变异形式包括（但并不限于）；若干个（通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8 个、1-5个、1-3个、或1-2个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端 添加或缺失一个或数个（通常为20个W内，较佳地为10个W内，更佳地为5个W内）氨基 酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功 能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质 的功能。该术语还包括褐藻胶裂解酶的活性片段和活性衍生物。
[0040] 多肤的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体、在高或低的严紧度条件下能与褐藻胶裂解酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明 还提供了其他多肤，如包含褐藻胶裂解酶或其片段的融合蛋白。
[0041] 发明还提供褐藻胶裂解酶或多肤的类似物。送些类似物与天然褐藻胶裂解酶的差 别可W是氨基酸序列上的差异，也可W是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。 送些多肤包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可W通过各种技术得到，如通过福射 或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类 似物还包括具有不同于天然k氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，W及具有非天然 存在的或合成的氨基酸（如目、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肤并不限于上 述例举的代表性的多肤。
[0042] 在本发明中，"褐藻胶裂解酶保守性变异多肤"指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相 比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个（如1个、2个