一种褐藻胶裂解酶Alga及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种褐藻胶裂解酶基因 alga。本发明还提供了含有该基因的载体和大 肠杆菌重组菌株及其表达产物的生产方法和应用。
【背景技术】
[0002] 褐藻胶是由a A-古罗糖醒酸（G)和目-D-甘露糖醒酸（M)两种单糖醒酸组成的 线型酸性多糖，广泛地存在于海带、裙带菜等大型褐藻类植物细胞壁中。随着糖生物学与糖 化学研究的逐步深入，许多海洋寡糖，尤其是褐藻胶的降解产物-褐藻胶寡糖具有多种生 物学活性。例如，低聚合度的褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤W及抗氧化等生物学 活性，有的已经开发为药品。W褐藻胶为原料制备褐藻胶寡糖有多种方法；酸解法、氧化降 解法、超声降解法和酶降解法。
[0003] 其中，酸解法和氧化降解法降解条件难W控制，操作较为复杂，耗时长。超声降解 法一般与其他降解法共同使用，降解产物聚合度高，不易制得寡糖；酶法降解相对于其他降 解方法具有降解条件温和，反应条件易于控制，产物特异性强，得率高等优点，因此成为制 备褐藻胶寡糖的首选方法。
[0004] 制备褐藻胶寡糖所使用的酶即褐藻胶裂解酶，属于多糖裂解酶家族成员，能够催 化糖醒酸单元之间的1，4糖巧键发生水解，在断裂后新形成的非还原端生成双键。按照其 底物特异性的差异，褐藻胶裂解酶可W分为H类；专一性降解聚甘露糖醒酸的聚甘露糖醒 酸裂解酶巧C4. 2. 2. 3)、专一性降解聚古罗糖醒酸的聚古罗糖醒酸裂解酶巧C4. 2. 2. 11)和 能降解上述两种片段的双功能褐藻胶裂解酶。由于其具有底物专一性，褐藻胶裂解酶主要 用于制备特异性结构的褐藻胶寡糖，研究褐藻胶的化学结构等方面；此外，褐藻胶裂解酶还 可W应用于治疗肺囊肿性纤维化，制备海带等大型褐藻的原生质体等。
[0005] 褐藻胶裂解酶主要来源于海洋动植物（包括海洋软体动物、海洋藻类）和多 种微生物（包括海洋细菌、±壤细菌和真菌）。根据其底物特异性不同，可分为两大类： 专一性降解聚甘露糖醒酸的裂解酶巧C4. 2. 2. 3)和专一性降解聚古罗糖醒酸的裂解酶 巧C4. 2. 2. 11);此外还有一些能够降解上述两种片段的双功能裂解酶，主要是来源于交替 假单胞菌N0272(Pseudoalteromonas sp. N0272)的褐藻胶裂解酶Aly ;从交替假单胞菌 Pseudoaltermonas SP.SM0524 中分离得到的 AlySJ-〇2 ;从 Isoptericola halotolerans 分 离得到褐藻胶裂解酶W及从麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomsa maltophiIia KJ-2)克隆得 到的褐藻胶裂解酶；W上四种裂解酶均具有降解PM和PG的能力，降解产物多为DP2-6的 寡糖。双功能的褐藻胶裂解酶由于其广泛的底物特异性而在工业生产上具有重要的应用价 值，主要用于褐藻胶寡糖的生产。本发明所涉及的褐藻胶裂解酶具有降解两种片段的能力， 同时对于不同底物的产物聚合度比较单一，均WH糖为主要产物，具有重要的工业应用价 值。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种新型褐藻胶裂解酶Alga及其编码基因。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种制备新型褐藻胶裂解酶Alga的方法。
[0008] 本发明的第H个目的是提供新型褐藻胶裂解酶Alga基因重组表达质粒和重组基 因工程菌株。
[0009] 本发明的第四个目的是提供新型褐藻胶裂解酶Alga在褐藻胶降解中的应用。
[0010] 本发明所提供的褐藻胶裂解酶Alga,来源于弧菌菌株Vibrio alginol^icus 40B，其氨基酸序列具有如下特征之一：
[0011] 1)序列表中的SEQ ID NO. 2从氨基端开始的第1-521或者18-521位氨基酸残基 序列，其中1-17位为信号肤序列，18-521位为有活性的褐藻胶裂解酶Alga的氨基酸。
[0012] 2)将序列表中的SEQ ID NO. 2从氨基端开始的第1-521位或18-521位氨基酸残 基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻胶活性的蛋白质。
[0013] 本发明提供了新型褐藻胶裂解酶Alga的编码基因（命名为alga),具有下述核巧 酸序列特征之一：
[0014] 1)序列表中SEQ ID NO. 1的脱氧糖核酸值NA)序列；
[0015] 2)编码序列表中SEQ ID NO. 1氨基酸序列的脱氧核糖核酸值NA)序列；
[0016] 本发明的新型褐藻胶裂解酶Alga的氨基酸序列及其核巧酸编码序列也可W根据 预测的Alga的氨基酸序列及其核巧酸序列人工合成获得。
[0017] 制备重组酶Alga的方法，是将编码基因 alga克隆到重组表达载体，导入宿主细 胞，获得重组表达的褐藻胶裂解酶。
[0018] 所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶Alga的表达载体可W是大肠杆菌表达载体、 酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、瞻菌体载体、丝状真 菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。
[0019] 用于重组表达内切褐藻胶裂解酶Alga的重组菌或转基因细胞系，可W是大肠 杆菌宿主细胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli D册 a 等）、酵母菌宿主细胞（如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces Iactis 等）、枯草杆菌宿主细胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主细胞（如 Lactic acid bacteria COCCIOI 等）、放线菌 宿主细胞（如Streptomyces spp.等）、丝状真菌宿主细胞（如I'richoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆虫细胞（女口 Bombyx mori，Antharaea eucalypti等）或哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞CH0,幼小 仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等）。
[0020] 本发明的新型褐藻胶裂解酶Alga来源于弧菌属菌株Vibrio alginol^icus 40B，通过基因组挖掘技术，分析Vibrio alginolyticus40B基因组中可能的褐藻胶裂解酶 基因，依据同源序列通过设计特异性引物，克隆得到褐藻胶裂解酶Alga全长编码基因，该 基因编码区长1566bp，编码521个氨基酸，分子量约为56. 72kDa，属于多糖裂解酶家族7。大 肠杆菌表达获得重组酶Alga, W褐藻胶为底物时，在3(TC、抑7. 0条件下具有最高酶活力， 比活力达到65. 97U/mg。
【附图说明】
[0021] 图I ;新型褐藻胶裂解酶Alga的蛋白质H维结构模型；整体结构为手套状-目-H 明治结构（glove-1化e-目-sandwich),其中包含3个小螺旋结构化1 :22-26 ;肥：76-79 ; 册=185-189) W及2个反向平行的目-折叠片A和B，A包含8个目-strand结构，B包含7 个目-strand结构。
[0022] 图2 ;新型褐藻胶裂解酶Alga表达及纯化的聚丙帰醜胺凝胶电泳图（SDS-PAGE)。 各泳道加入的样品分别是；M ;蛋白标准分子量（marker)，条带自上到下顺序为；170kDa， 130kDa，110kDa，70kDa，55kDa，40kDa，35kDa，25kDa ;泳道 1 ;重组菌体破碎后上清，上样量 为10 U 1，泳道2 ;重组菌破碎后上清经媒柱纯化的流出液，上样量10 U 1 ;泳道3: IOmmol咪 哇洗脱液，上样量10 U 1 ;泳道4 ;20mmol咪哇洗脱液，上样量10 U 1 ;泳道5 ;50mmol咪哇洗 脱液，上样量10 y 1 ;泳道6 ;250mmol咪哇洗脱液，上样量10 U 1。
[0023] 图3 ;温度对于褐藻胶裂解酶Alga活性的影响。
[0024] 图4神对于褐藻胶裂解酶Alga活性的影响。
[00巧]图5 ;温度对于褐藻胶裂解酶Alga的稳定性的影响。
[0026] 图6 ;抑对于褐藻胶裂解酶Alga的稳定性的影响。
[0027] 图7 ;褐藻胶裂解酶Alga的底物偏好性曲线。
[0028] 图8 ;褐藻胶裂解酶对于H种底物的降解产物ESI-MS图谱。A ;褐藻胶底物的降解 产物的ESI-MS谱图，B =POlyM底物的降解产物的ESI-MS谱图，C =POlyG底物的降解产物的 ESI-MS 谱图。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] Vibrio alginolyticus 40B的培养及菌株基因组DNA提取
[0031] 所采用的菌种为弧菌W13,挑取Vibrio SP. W13菌株的单克隆菌落接种到50ml液 体培养基中，接着放入温度为30°C、转数为22化pmin的摇床培养24小时后，将培养液离必 收集菌体并丢弃上清培养基。
[0032] 使用的液体培养基配方为（g/L);牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉l.Og、化Cl 5. Og、M拆04 . 7肥0 0. 5g、CaC12 0. 2g、KH2P04 1. Og、FeS04 . 7肥0 0. 02g，抑值为 7. 0。
[0033] 取4mL已经培养好的菌液，置于2血化be管中，5000g，IOmin充分离必。弃去上 清，采用细菌基因组提取试剂盒（Thermal Scientific, USA)进行基因组提取，操作如下： 用180 U L消化液值igestion Solution)将菌体重悬，再加入20 U L蛋白酶K，充分混匀后， 56°C温育30min。加入20 U L化aseA，充分混匀后，室温放置lOmin。加入200 U L裂解液 化ysis Solution),快速混匀，过程不要超过15s。加入400 JiL 50% (v/v)己醇溶液，充分 混匀。将上述溶液转移至吸附柱中，静置Imin,离必6000g，Imin,弃废液，将吸附柱转移至 一个新的2血1:ube管中。加入500 y L wash buffer I，SOOOg, Imin离必，弃废液。加入 500 y L wash buffer II，SOOOg, Imin 离必，弃废液。重复一次。将空吸附柱 12000g, 3min 离必，将柱内残留液体充分甩干。在吸附柱基质膜中间位置加入200uL洗脱液巧Iution Buffer)静置Imin, SOOOg, Imin离必，即得基因组。
[0034] 实施例2褐藻胶裂解酶Alga编码基因的克隆与鉴定
[0035] 根据与Vibrio alginolyticus40B基因组中可能的褐藻胶裂解酶基因 设计如下扩增引物：上游引物巧'-CGCATGAAGCATATTTTCTTCAA-3')和下游引物 (5' -CCGGCCTTGGTACTTACCAAAAG-3' )。W提取的菌株基因组为模板，进行PCR扩增得到褐 藻胶裂解酶Alga基因全长序列。PCR条件为；94°C预变性3min，随后W94°C 30s、55°C 30s、 72°C 2min进行30个循环，最后在72°C延伸lOmin。琼脂糖凝胶电泳显示在I. 0化和2. 0化 之间有一条特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。
[0036] 将纯化的DNA片段连接到克隆载体PMD19-T上，转化大肠杆